A avaliação da mutagenicidade dos trabalhadores expostos no curtume foi realizada com os testes citogenéticos de micronúcleo em células esfoliadas do epitélio bucal em cultura de linfócitos com bloqueio da citocinese, como também, pelo teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos.
4.3.1.teste de micronúcleos
Os MNs representam marcadores simples, e são considerados valiosos na avaliação de danos citogenéticos de populações ocupacionalmente expostas a diversos agentes químicos.
4.3.1.1.teste de micronúcleo em células esfoliadas de epitélio bucal
O teste de MN foi realizado nas células epiteliais da mucosa oral de acordo com Holland et al., 2008. A coleta de células bucais foi obtida através de fricção na bochecha dos indivíduos com escova cytobrush. As células foram coletadas em tubos falcon contendo 5mL de solução salina (0,9 %) e transportada para processamento no Laboratório de Toxicologia e Genética Molecular LAB- TOXIGEN do LACEN-PI. Após três lavagens com PBS por centrifugação à 1500 rpm por 10 minutos, com a retirada do sobrenadante entre as centrifugações, 50 μl de suspensão de células foram gotejadas sobre lâminas pré-aquecidas (37º C) em chapa aquecedora. Em seguida, as células foram fixadas com metanol: ácido acético (3:1) durante 15 min, e dispostas horizontalmente à temperatura ambiente por 24 horas. Após esse período, as lâminas foram colocadas em água destilada por 1 minuto para hidratação das células, antes de realizar a coloração. As células foram coradas com Giemsa 10% durante 15 minutos. Realizou-se a lavagem das lâminas por duas vezes com água destilada durante 3 minutos para retirar o excesso do corante. Após secas, as lâminas foram examinadas em microscopia óptica, com o aumento de 1000 X (Figura 13). Foram contadas cerca de 2.000 células para cada indivíduo. Os critérios de identificação do MN foram os descritos por (Holland et al., 2008), como estruturas que apresentem distribuição cromatínica e coloração igual (ou mais clara) do que a do núcleo, que estejam no mesmo plano que este, apresentam limites definidos e semelhantes aos nucleares e o seu tamanho não ultrapassar 1/3 do tamanho do núcleo (Holland et al., 2008).
Figura 13.Esquema simplificado do Teste de MN em mucosa bucal representado segundo protocolo de Holland et al. (2008).
4.3.1.2.Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese
Para o teste de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CbMN) o sangue foi coletado em seringas previamente heparinizadas. Cerca de 0,5 mL de sangue foi colocado em 4-5 mL de RPMI 1640 suplementado com 15 % de soro bovino fetal, 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicina), 1% de L-glutamina e 1% de fitohemaglutinina. Os linfócitos são incubados por 7 h em até 37ºC. A citocalasina B foi preparada em DMSO na concentração de 6 g/mL e estocada em 20ºC. Essa solução foi adicionada na cultura em 44h. Após as 72h de incubação as culturas foram centrifugadas em 800 rpm por 8 minutos para eliminar as células vermelhas. As células lavadas em RPMI 1640 e tratadas em um meio hipotônico por 2-3 min em 0,075 M de KCL a 4ºC. O procedimento foi feito por 3X. As células foram centrifugadas e adicionadas na solução com metanol-ácido acético 3:1 e gentilmente agitadas. Esse processo foi repetido por 3X. As células foram ressuspendidas e colocadas em lâminas e coradas com GIEMSA a 10% em tampão fosfato a pH 6.8, por 10 minutos (Figura 14). As células foram observadas em microscopia óptica em objetivas de 100X e fotografadas. 1000 células binucleadas com citoplasma preservado foram avaliadas quanto à frequência de micronúcleos (Fenech, 2007).
Figura 14. Esquema simplificado do Teste de MN em linfócitos com bloqueio de citocinese (CbMN) (Fenech, 2007).
4.3.2.teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos
As preparações metafásicas para a análise convencional de AC foram efetuadas de acordo com Sram et. al. (2007), seguindo os seguintes passos
(Figura 15), através de punção venosa de cada indivíduo foram coletados cerca de 5 mL de sangue periférico com seringa heparinizada, estéril e descartável. Foram adicionadas 18 gotas do sangue em culturas de 5 mL de meio RPMI 1640, suplementado com 15 % de soro bovino fetal, 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicina), 1% de L-glutamina e 1% de fitohemaglutinina( para estimular a divisão celular). As culturas foram incubadas em estufa comum a 37 ºC por 72 horas. Adicionou-se a colchicina (16 g/mL, Sigma), 2 horas antes de completar 48 horas de incubação para obtenção de células em metáfase. Após às 72 horas de incubação, a cultura de linfócitos foi transferida para um tubo falcon de 10 mL estéril e centrifugada a 1000 rpm por 5 minutos, fazendo uma lavagem com solução hipotônica (0,075 M) para rompimento das membranas celulares. Adicionou-se 5 mL de fixador, que consiste em metanol e ácido acético (3:1). As lâminas foram preparadas pelo método de Moorhead et al. (1960) modificado e as metáfases foram coradas com Giemsa (10%), diluído em tampão Sorensen para posterior visualização ao microscópio. Foram analisadas 100 metáfases/indivíduo bem espalhadas e sem sobreposição, em microscópio de luz e em objetiva de imersão. Dentre as AC foram avaliadas em 100 metáfases, identificadas em 300 células de cada indivíduo, os cromossomos dicêntricos e tricêntricos, cromossomos em anéis e em anéis acêntricos, fragmentos cromossômicos, deleções terminais e deleções intersticiais foram identificados segundo Tolbert et al. (1991).
Figura 15. Esquema representativo do Teste de Aberrações Cromossômicas montado segundo o protocolo de Sram et al.(2007).
4.3.3.Dosagem do cromo na urina
Devido ao grande debate acerca do cromo III e sua possível genotoxicidade, fez-se uma coleta de urina afim de quantificarmos o referido metal nos indivíduos estudados. Este procedimento se processou durante a coleta das amostras de sangue e da mucosa bucal. Os primeiros 27 (vinte e sete) indivíduos que forneceram material para as análises.
O equipamento utilizado na determinação de cromo na urina foi um espectrômetro de absorção atômica AAnalyst 800 equipado com atomizador eletrotérmico transversal, corretor de fundo Zeeman longitudinal e amostrador automático AS-800, todos Perkin-Elmer( Norwalk , CT , USA ). Tubos “end cap” recobertos com grafite pirolítico (Perkin Elmer Part N°B3000655) foram usados nesses experimentos. O comprimento de onda da lâmpada de catodo oco (Perkin- Elmer Part N°N3050119) de cromo foi de 357,9 nm, enquanto que a largura da fenda foi de 0,7nm. A metodologia para a determinação do cromo em urina seguiu o protocolo já estabelecido pelo Setor de Metais da FIOCRUZ. As condições STPF ("Stabilized Temperature Platform Furnace") foram adotadas no forno de grafite para reduzir, ou até mesmo eliminar, as interferências. Entre elas, está a utilização de um modificador químico, necessário em matrizes mais complexas, como é o caso da urina, e leituras em área de pico. A exatidão dos resultados é acompanhada através da análise, em cada série de amostras, de materiais de referência.
Toda a vidraria e utensílios plásticos utilizados ficaram imersos em uma solução de Extran 5% v/v, por um período mínimo de 24 horas. Após este tempo, o material foi enxaguado com água corrente em abundância e, em seguida, imerso em uma solução de ácido nítrico 10% v/v para a descontaminação por, pelo menos, 48 horas. Após serem enxaguados várias vezes com água deionizada do Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) , esse material foi seco em estufa a 30ºC, devidamente protegido de contato com superfícies metálicas e de poeira até o uso.
Todos os reagentes (Merck, Elmsford , NY , USA ) e água utilizados foram da mais alta pureza:
· Padrão de Cr
· Ácido nítrico p.a.; Soluções:
· Solução estoque de Cr: 1000 µg mL-1 preparada a partir do
concentrado Titrisol-Merck
· Solução de trabalho de Cr: 1,00 µg mL-1 preparado a partir da
solução acima, por diluição adequada com HNO3 0,2 % v/v;
· Modificador Químico: solução de Mg(NO3)2 0,5% m/v em HNO3
0,2 % v/v.
Preparação das amostras
A urina foi diluída 1+1 em ácido nítrico 0,2% (v/v), enquanto que a amostra de referência Seronorm Trace Elements Urine Lot 0511545 (19,7 +/- 1,3 µg L-1), foi reconstituída de acordo com as recomendações do fabricante e diluída cinco vezes também em ácido nítrico.