TARTIŞMA VE SONUÇ

4.1. Mağaralardan Aktinomiset Đzolasyonu ve Korunması

Toprak altı yaşam çevrelerinin mikrobiyolojik özellikleri çok ilgi çeken bir konu olsa da, bu ortamlarda bulunan aktinomisetler ile ilgili çalışmalar son 20 yılda önceye uzanmamaktadır. Mağaralardan aktinomiset izolatlarının elde edilmesi amacı ile Groth ve arkadaşları (1999 a,b), klasik seyreltme plaka yönteminin yanı sıra direk örnekleme amacı ile mağara oluşumlarını yüzey sürme yöntemi ile örneklemişlerdir. Bu çalışmalar sonucunda mağaralardan elde edilen yeni aktinomiset türlerinin sayısının giderek arttığı görülmektedir (Groth et al., 1999a, 2002, Lee et al., 2000).

Bu çalışmada, ülkemizin Ankara, Antalya, Bartın, Balıkesir, Bilecik, Bursa, Eskişehir, Đzmir, Karabük ve Konya gibi illerinden toplam 19 mağaradan yapılan örnekleme sonucunda 290 aktinomiset izole edilmiştir. Đzolasyon direkt temas ve seyreltme plaka yöntemleri ile gerçekleştirilmiş olup, elde edilen izolatlar nişasta kazein agar içeren tüplerde +4°C’de ve/veya %20’lik gliserol içeren cryotüplerde -20°C’de muhafaza edilmiştir.

Pek çok araştırmacı benzer izolasyon yöntemlerini kullanarak mağaralardaki mikrobiotayı incelemiş, ilgi çekici sonuçlar elde etmişlerdir.

Laorpaksa ve arkadaşları (1987) Tayland da altı farklı mağara toprağından aktinomiset izolasyonu ve antibiyotik üretimi çalışmalarında, mağaradan izole edilen örnekleri 6 cm derinlikteki kaplarda +4 °C’ de muhafaza etmişlerdir. 10 g toprak örneği ile hazırlanan dilüsyonları, Patato Dextrose Agar’ a ekmiş 28-30 °C’ de 3-5 gün inkübasyon sonunda oluşan kolonileri PDA tüplerine aktarıp +4 °C’ de muhafaza etmişlerdir.

Gonzelez ve arkadaşları (1999) güney Đspanya’ da Atlanterra mağarasında yaptıkları çalışmada, mağara duvarlarındaki tarih öncesi resimlerden bakteri izolasyonu yapmışlardır. Đzole edilen 21 bakterinin izolasyonu Hygincult ve Tryptic Soy Agar plaklarında inoküle edilerek sağlanmıştır.

Canaveras ve arkadaşlarının (1999) yaptığı araştırmada mağaralardan izole edilen Streptomyces izolatlarının laboratuar ortamında kalsiyum karbonatı çöktürme özelliğinde oldukları tespit etmiştir. Bu araştırma aktinomisetlerin mağara mineral depolarının oluşumunda rol oynayabilecekleri görüşünü desteklemektedir.

111

Groth ve arkadaşlarının yaptığı diğer bir çalışmada mağara tavan ve duvarları üzerindeki nemli alanlarda kümelenmiş beyaz noktalar biçiminde görülen kolonilerin aktinomiset kolonisi olduğu ve bu aktinomisetlerin önemli kısmının kaya ve oluşum yüzeylerinde göz ile görülebilen büyüklükte koloniler oluşturabildiği tespit edilmiştir.

Doğrudan kolonilerden izolasyon yolu ile elde edilen aktinomiset türleri arasında Streptomyces, Amycolatopsis, Nocardia, Nocardioides, ve Rhodococcus cinslerine ait örnekler sayılmaktadır (Groth et al., 1999 b).

Groth ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmalar (2001), bu mağaradan elde edilen aktinomiset izolatlarının mağaradaki sarkıt, dikit vb. mineral depolarının oluşumunda önemli role sahip olduğunu vurgulamaktadır.

Annette ve arkadaşları (2001) Virginia Cesspool mağarasında yaptıkları araştırmada, mağaranın hidrojen sülfatça zengin sularından ve duvar su filmlerinden izole ettikleri örnekleri steril tüplere almış ve laboratuarda % 50 (v/v) gliserol içeren tüplerde -80 ^°C’ de muhafaza etmişlerdir.

Herold ve arkadaşları (2005) Đtalya’ daki antik Grotta dei Cervi mağarasında yaptıkları araştırmada 5000 yıllık (kırmızı ve siyah renkteki boyalarla) mağara resimlerinin, çevresinden izole ettikleri Streptomyces türü (Streptomyces tendae) tarafından üretilen Cervimycin isimli yeni bir antibiyotiği, fermantasyon ve izolasyon çalışmaları sonucunda bulmuşlar ve analiz etmişlerdir.

4.2. Test Mikroorganizmalarına Karşı Antimikrobiyal Aktivitenin Belirlenmesi Bu çalışmada, 19 doğal mağaradan izole edilen 290 izolatın “agar piece” metodu ile antimikrobiyal aktivite sonuçlarında, kültürlerin bir kısmının mikroorganizmalar karşı aktivite göstermediği, bir kısmının sadece bakterilere, mayalara ya da küflere etkili oldukları tespit edilmiştir. Standart test mikroorganizmalarına karşı geniş spektrumlu etki gösteren, 5 izolat, gram (+), gram (-) bakteriler, mayalar ve küflerden en az birine etkilidir. Bunlar, diğer izolatlara göre çok daha yüksek zon çapları ile dikkat çekici sonuçlar veren aktinomiset izolatlarıdır. Bakterilere karşı 20 mm ve üzerinde zon çapı veren 8, mayalara karşı 4, küflere karşı 2 aktinomiset izolatı tespit edilmiştir.

112

Uygulamalarda kontrol olarak Kloramfenikol, Mikostatin antibiyotikleri kullanılmıştır. Alınan sonuçlarda bazı aktinomiset izolatları kontrol olarak kullanılan antibiyotiklerden daha yüksek zon çapı vermişlerdir. Kloramfenikol’ den daha yüksek zon çapı veren 22, Mikostatin’den daha yüksek zon çapı veren 16 izolat bulunmaktadır. Çalışmamızda kullanılan ve etki mekanizmaları bilinen bu iki antibiyotikten, daha iyi sonuçlar alınması umut vericidir.

Aktinomiset kültürlerinin % 33’ü sadece gram (+) bakteriler, %27’ si sadece gram (-) bakteriler ve % 15,17’si her iki grup üzerinde antibakteriyal etkili oldukları, % 19 unun mayalar, % 14,82’ sinin küfler üzerinde etkili oldukları; bununla beraber

%38,1’inin de etkisiz oldukları saptanmıştır.

Doğal mağaralar biyoaktif metabolit üretme potansiyeline sahip aktinomiset izolatlarının eldesi için ideal ortamladır. Özellikle son yıllarda bu konu üzerinde pek çok araştırmacı mağaralardan izole edilen aktinomisetlerin özellikleri ve antimikrobiyal aktiviteleri üzerine çalışmalar yapmışlardır.

Laorpaksa ve arkadaşları (1987) Tayland da altı farklı mağara toprağından izole edilen 104 aktinomiset örneğinden, 51 aktif örnek arasından, test mikroorganizmalarına karşı antimikrobiyal aktivite oranının % 49.04 olarak belirlendiği bu çalışma da var olan potansiyeli ifade etmektedir.

Mallory ve arkadaşları (1994) mağaralardan izole ettikleri mikroorganizmalarla yaptıkları çalışmalarda kanser kemoterapisinde kullanılabilecek metabolitler üreten mikroorganizmalar rapor etmişlerdir.

Kim ve arkadaşları (1998), doğal mağaralardan bitki patojeni fungusların inhibisyonu amacı ile antagonistik aktinomiset izolatları elde edebilmişlerdir. Bu çalışmada Kore’ deki çeşitli doğal mağaralardan elde edilen toplam 136 aktinomiset izolatının 96 kadarının antifungal aktiviteye sahip oldukları belirlenmiştir.

Groth ve Saiz-Himenez’ in yaptığı çalışmada (1999), mağarada yer alan heterotrof bakteriler arasında aktinomisetlerin dominant olduğu ifade edilmektedir.

Nakhimovskaia’ nin (1937), Kuzey Kanada topraklarından izole edilen 600 aktinomisetin antibiyotik aktivitesi üzerine yaptığı çalışmada, izole edilen kültürlerin

%47’ sinin S. aureus, %8.2’ sinin E.coli, %19.5’ inin Mycobacterium tuberculosis üzerine etkili oldukları saptamıştır.

113

Nedialkova ve arkadaşları tarafından (2004, 2005) Antartica’ da yapılan diğer bir çalışmada, topraktan izole edilen 40 aktinomiset ile 7 farklı gram (+), gram (-) bakteri ve 16 farklı fungus test mikroorganizması olarak kullanılmış ve birçok aktinomiset örneğinden olumlu sonuç alınmıştır.

Ülkemizde, Streptomyces genusuna ait detaylı bir çalışmada (Denizci, 1996), Ege ve Doğu Karadeniz bölgesinde çeşitli lokalitelerden izole edilen suşların genel antibakteriyel aktivitesi araştırılmış ve dört ayrı tür, Williams ve arkadaşları’nın (1983) yöntemine göre tanımlanmıştır.

Aslan (1999) Çukurova üniversitesi kampusü toprağından, Streptomycetes genususna ait 12 Streptomycetes türünün izolasyonunu gerçekleştirmiş ve yüksek aktiviteye sahip 4 suş tanımlaması yapılmıştır.

Yıldırım (2004) yaptığı çalışmasında, Eskişehir il sınırları içindeki çeşitli lokalitelerden alınan 390 adet aktinomiset izolatının % 23’ ünün bir ya da daha fazla test mikroorganizmasına karşı aktif olduğu, % 40’ nın antifungal aktiviteye, % 73’ nün antibakteriyal aktiviteye sahip olduğu tespit edilmiştir. Gr (-) bakterilerin diğer test mikroorganizmalarına nispeten daha yüksek aktiviteye sahip olduğunu tespit etmiştir.

Şahin ve arkadaşları tarafından (2003) yapılan başka bir çalışmada ise, Muğla yöresi topraklarından 74 farklı Streptomyces izolatı elde edilmiş, bazı Streptomyces izolatlarının antimikrobiyal aktivitelerinin araştırılmıştır. Đzolatların %45.9’ unda antimikrobiyal aktivite belirlenmiştir. 15 izolat koagulaz-negatif Stafilokoklara (CoNS) karşı güçlü antimikrobiyal aktivite gösterilmiştir. Bu izolatların Gram pozitif, Gram negatif bakteriler ve mayalara karşı in vitro antimikrobiyal aktiviteleri kapsamlı olarak çalışılmıştır. Sonuçlar göstermiştir ki, 5 izolatın 20 mm inhibisyon zonuyla CoNS ve mayalara karşı yüksek derecede aktiftir. Bu izolatların üçü, Streptomyces antibioticus (MU106, MU107) ve S. rimosus (MU114) olarak tanımlanmıştır.

Çalışmamız, doğal mağaraların izolasyon ortamı olarak seçilmesi, antimikrobiyal aktivite tespiti için bakteri, maya , küf gibi farklı mikroorganizmalarla çalışılmış olması ve benzer çalışmalardan daha geniş etki alanı araştırılmış olması, dikkat çekici sonuçlar alınması ve tabi ülkemizde alanında yapılan ilk çalışma özelliği taşıması nedeni ile dikkat çekicidir.

114

4.3. Aktinomisetlerin Klinik Đzolatlara Karşı Antimikrobiyal Aktivitesinin Belirlenmesi

Antimikrobiyal aktivite belirleme çalışmalarında izlenen yöntemin aynısı, klinik izolartlardan MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), VRE (Vancomycin Resistant E. faecium), A. baumanii ile kanlı agarda, 7 aktinomiset izolatı (105, 320, 404, 1421, 1492, 1613, 1910 kodlu) ile gerçekleştirildi. Alınan sonuçlarda özellikle 1492 kodlu izolatın her üç klinik bakteriye karşı etkili olduğu ve kullanılan standart antibiyotiklerden daha yüksek aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalarda da dirençli bakterilere karşı etkili izolatı bulmak ilk hedeflerdendir. Bu nedenle çalışmamız dikkat çekici sonuçlar vermiştir. Ayrıca 1492 kodlu izolatın yanı sıra, 105, 320, 1421, 1910 kodlu izolatların da bazı klinik izolatlara karşı aktivite gösterdiği tespit edilmiştir.

Ülkemizde Çolak (2006) doktora tezinde, Đtalya da Herold ve arkadaşları (2005) araştırmalarında, benzer yöntemlerle klinik bakterilere karşı antimikrobiyal aktivite çalışmaları yapmışlardır. Özellikle son yıllarda klinik izolatlara karşı aktivite gösteren izolatlar ve ürettikleri aktif madde üzerine çalışmalar artmaktadır. Araştırmacıların ortak hedefi antibiyotiklere karşı dirençli olan ve giderek sayıları artan mikroorganizmalara karşı yeni ve etkili antibiyotik keşifleridir. Bu aşamada çalışmamız, özellikle 1492 kodlu izolattan alınan sonuçlar açısından umut vericidir.

4.4. Numerik Taksonomi ile Đzolatların Tanılanması

Bu çalışmanın hedeflerinden birisi de antimikrobiyal aktivite gösteren Streptomyces izolatlarının nümerik metodlarla değerlendirilmesidir. Bu amaçla izolat suşlarla birlikte tanımlanmış Streptomyces tip türleri ve duplike suşların ilave edildiği test organizmaları için, standart nümerik testler tasarlanmış ve uygulanmıştır.

Nümerik taksonomi, çok sayıda ve eşit önemde karakterin birlikte değerlendirilmesine dayalı olarak gerçekleştirildiği için, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği yüksek görülmektedir. Nümerik taksonomik çalışmalardan elde edilen verilerin güvenilirliğinin artmasını sağlayan diğer bir faktör ise, aynı suşların farklı numara ile kodlanarak duplikat olarak testlere dahil edilmesi ve elde edilen

115

sonuçların karşılaştırılmasıdır. Bu yolla test hatası hesaplanarak, çalışmanın güvenilirliği de kontrol edilmektedir. Ayrıca, kullanılan her bir karakter, gösterdiği test hatasına bağlı olarak tekrarlanabilmektedir. Bir karaktere ilişkin test hatası yüksek ise, bu testin hesaplamalardan çıkartılması ve bu yolla elde edilen sonuçların doğruluk oranının arttırılması da mümkün olabilmektedir. Bu çalışmada klorid (% 13) te büyüme (AAV), gallik asit kullanımı (ADB), safranin kullanımı (AEA), kahve havasal misel ve spor kitlesi rengi (AEG), kırmızı havasal misel ve spor kitlesi rengi (AEH), siyah havasal misel ve spor kitlesi rengi (AEL), eflatun çözünür pigment rengi (AEV), kırmızı çözünür pigment rengi (AEW) ve verticillate tipte spor zinciri (AFD) karakterleri, yüksek test hatası nedeni ile son veri matrisinden çıkarılmıştır. Sonuç olarak elde edilen toplam test hatası değeri % 0.5 olarak hesaplanmıştır. Test hatasının % 10 oranına kadar kabul edilebilir olarak değerlendirildiği göz önüne alınır ise (Sneath and Johnson, 1972), verilerin güvenilirliği ve tekrarlanabilirliğinin yüksek olduğu düşünülebilir.

290 örnek arasından seçilen 1492 kodlu izolat test mikroorganizmalarından gram (+), gram (-) bakteriler ve klinik bakteriler üzerinde etkili olmuştur. Ayrıca numerik taksonomi ile izolatların tanılanmasında, antimikrobiyal aktivite belirleme testlerinde denenen 12 (8 bakteri,4 fungus) mikroorganizmaya karşı antimikrobiyal aktivite gösterdiği ve tip türler ile benzerlik derecesinin düşük olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma sonuçları ışığında Streptomyces M1492 kodlu izolat sonraki aşamalar için seçilmiştir.

4.5. Antimikrobiyal Etkili Maddenin Üretimi

Bu aşamada sporulasyon, üretim ortamları için seçilen besiyeri içeriği, besiyerinin pH’ sı, uygun sıcaklık, çalkalama hızı ve üretim süresi aktinomisetin gelişmesi ve antimikrobiyal etkili madde üretimi açısından önemlidir. Bu nedenle daha önceki araştırmalarda kullanılan yöntemler araştırılmış ve araştırmalardan alınan sonuçlar ışığında uygun besiyeri içeriği ve parametreler seçilmiştir.

El-Enshasy ve arkadaşları (2000), Şahin ve arkadaşları (2003) Streptomyces’

lerin sporulasyonu için ISP2 kullanmışlardır. Yapılan çalışmalar en iyi sporlanmanın

116

ISP2 ortamında 7 gün 28°C’ de inkübasyon ile sağlandığını göstermektedir. Bu nedenle çalışmamızda sporulasyon için ISP2 ve Đnorganik Tuz-Nişasta Agar (ISP 4) ortamları kullanıldı.

Laorpaksa ve arkadaşları Tayland’ da (1987), fermantasyonla üretim aşamalarında sıvı ortam olarak üç farklı ortam kullanmış en iyi sonucu soya unu ortamından almışlardır.

Gesheva ve arkadaşlarının (2004) Streptomyces hygroscopicus’ in ürettiği antibiyotik üzerine yaptıkları çalışmada, fermantasyonla üretim aşamasında soya unu katkılı besiyeri ortamı kullanmışlar ve besiyerine % 0.5 oranında soya unu ilavesinin antimikrobiyal aktiviteyi etkilediği belirtmişlerdir.

Soya ununun azot kaynağı olarak fermantasyon ortamında mikrobiyal büyüme için uygun bir ortam olduğu pek çok araştırmacı tarafından tespit edilmiş ve birçok araştırmacı tarafından kullanılmıştır (Denizci, 1996).

Çalışmamızda ISP2 petrilerinde 7 gün gelişen sporlardan daha sonra soya unu içerikli gelişim ortamına 1x 10⁸ , daha sonra da gelişme ortamından soya unu içeren fermantasyon ortamına % 5 oranında inokulasyon yapılmıştır.

Çalışma sonuçlarında besiyerinde bulunan glukoz miktarının önemini göstermektedir. Glukoz miktarının 20-30 g/ml arasında olduğu besiyerlerinde gelişimin daha iyi sonuçlar verdiği yine pek çok araştırmacı tarafından belirtilmiştir;

Gupte ve arkadaşları (2002) glukoz miktarını 20-30 g/ml, Harindran ve arkadaşları (1999), 16-41 g/l, Gesheva ve arkadaşlarının (2004), 30 g/l olarak kullanmışlar ve gelişim için uygun olabileceğini araştırma sonuçlarında belirtmişlerdir. Besiyerinde bulunan glukoz miktarının antimikrobiyal aktiviteyi, gelişimi ve dolayısı ile hücre ağırlığını etkilediği düşünülmektedir. Karbon kaynağının 5. günde tamamen tükendiği ve aynı gün antimikrobiyal aktivitenin maksimum seviyede olduğu görülmektedir.

Gelişimin ilk gününden itibaren C kaynağını hızla tüketen hücrelerin, maksimum üretimin olduğu 5. -6. günlerde kuru hücre ağırlığının 6,19 - 7,35 g/l olduğu ve bu günlerden itibaren artışın hızla devam ettiği görülmektedir.

pH düzeyinin 6-8 arasında gelişim için uygun olduğu pek çok araştırmacı tarafından belirtilmiştir; Gesheva ve arkadaşları (2004) pH 6,8, Harindran ve arkadaşları (1999) pH 6,1-7,38, Naik ve arkadaşları (2000-2001) pH 6,6-7,1, bu tespitleri yapan araştırmacılar arasındadır.

117

Çalışmamızda sıvı besiyerinin pH’ sı 6,8 olarak ayarlanmıştır. pH seviyesinin ilk üretimin başladığı 3. güne kadar çok az miktarda düştüğü fakat daha sonra 8,3’ e kadar arttığı gözlenmiştir.

Besiyerinin pH 'sının değişmesinde besiyerine katılan ve fermente olabilir karbonhidratların ayrışması sonu oluşan organik asitlerin, nitrogenli veya proteinli maddelerin dekompoze olması neticesinde meydana gelen amonyak veya alkalen maddelerinin önemi fazladır. Ayrıca, hücrede oluşan ve dışarı çıkan diğer metabolizma artıkları da pH 'nın değişmesine büyük ölçüde etkilerler. Üremeyi olumsuz yönde etkileyen pH değişmesini önlemek için, besiyerine buffer'ler katılır. Bu amaçla, genellikle, ayrı ayrı veya birlikte K₂HPO₄ veya KH₂PO₄ kullanılır. Bunlar meydana getiren hidrojen (H) ve hidroksil (OH) iyonlarının serbest kalmasının önüne geçer ve onlarla birleşikler oluşturur. Bu nedenle de, ortamın pH 'sı hemen asit veya alkali olmaz bir süre optimal limitler arasında kalır (Arda, 2000).

4.6. Antimikrobiyal Etkili Maddenin Đzolasyonu ve Biyootografi

Fermantasyon sonucunda etken maddenin izolasyonu ve aktivite tespiti için özel analizler gerekmektedir.

Aktinomiset izolatının (1492 kodlu) ürettiği antimikrobiyal etkili madde izolasyonu için öncelikle uygun solvent ekstraksiyonu seçimi yapılmıştır. Sonuçta maddenin, etil asetat ve dietil eterde çözündüğü ve disk difüzyon yönteminde şeffaf zon oluşturduğu belirlenmiştir. Daha sonra maddenin polarite durumu belirlenmiş ve maddenin polar çözücülerde özellikle suda iyi çözüldüğü gözlenmiştir.

Bu sonuç etken maddenin izolasyonu için gerekli en kritik bilgiyi sağlamaktadır.

Polaritesi tespit edilen maddenin izolasyonu için bir sonraki aşama Đnce tabaka kromatografisi (ĐTK) sonucunda, maddenin oluşturduğu spotların R_f değeri hesaplanmıştır.

Hazırlanan solvent sistemlerinde, Su : Metanol , 25 : 75 oranında Rf değeri 0,50 olduğu, Su : Metanol, 30 : 70 oranlarında Rf değeri 0,52 olduğu , Su : Metanol : Etanol, 20 : 75 : 5 oranında Rf değerinin 0,72 olduğu, Su : Metanol : Etanol, 25 : 70 : 5 oranında Rf1 değerinin 0,50 olduğu Rf2 değerinin 0,71 olduğu belirlenmiştir. Oluşan

118

spotların biyolojik aktiviteleri biyootografi yöntemiyle belirlenerek, spotların bu çözücü sistemlerde aktif olduğu tespit edilmiştir.

Sıra ile önce maddenin polaritesinin belirlenmesi için solvent sistemi seçilmiştir.

Bu şekilde ĐTK için uygun sistemle denemler yapılmıştır. ĐTK ile kültür sıvısında varolan maddelerin spotlar oluşturması sağlandı. Kültür sıvısı içeriğindeki maddeler polaritelerine göre farklı noktalarda spotlar oluşturacağından, sıvı içerisinde kaç farklı madde olabileceği tespit edilmiştir. Bu durum antibakteriyal aktivite gösteren iki fraksiyonunun farklı polaritelere sahip olduğunu düşündürmektedir. Kullanılan çözücü sistemine bakıldığında; R_ƒ değeri 0,50 olan maddenin nispeten polar yapıda, R_ƒ değeri 0,71 olan maddenin ise daha apolar yapıda olduğu söylenebilir. Oluşan farklı spotlardan hangisinin antimikrobiyal etkili maddeye ait spot olduğunun tespiti için biyootografi çalışması yapılmıştır. Oluşan zonun ölçülen R_ƒ değeri 0,50 olanının antibakteriyal etkiye de neden olduğunu düşündürmektedir. Burada tespit edilen iki spot, aktinomiset izolatının iki ayrı madde ürettiğini ancak bunlardan sadece birinin antimikrobiyal etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

Đnce tabaka kromatografisinin etken maddenin eldesi için en ucuz ve basit yol Denizci (1996) tarafından da vurgulanmıştır. Denizci (1996) yaptığı çalışmasında, bu yöntemde, birçok örneğin tek bir plakada incelenmesi ve sülfirik asit spreylenmesi sonucu organik fraksiyonların ısıtılarak görülebilir hale geçirilmesinden dolayı, bu tekniğin avantajlı olduğu araştırmacılar tarafından da bildirildiğini belirtmiştir. Bu nedenle aktif molekül izolasyonu ile ilgili yaptığı her basamakta, fermantasyon sıvısından elde edilen ekstrakt ince tabaka kromatografisi ile incelemiştir.

Pelàez ve arkadaşlarının (1998) yaptığı çalışmada antimikrobiyal etkili maddenin izolasyonu çalışmalarında uygun solvent seçimi için 2 ml üretim ortamı, 2 ml çözücü ilavesinin 15 dk çalkalama, daha sonra 15 dk 3000 devirde santrifüj işlemleri uygulanmıştır. Disk difüzyon yöntemiyle aktivite çalışmaları yapılarak antimikrobiyal aktivite belirlenmiştir. Bu araştırmada kullanılan yöntem çalışmamızda da başarı ile kullanılmıştır.

Paradkar ve arkadaşları (1998) streptoverticillium sp ile yaptıklar çalışmalarda butanol-asetik asit-su (4:1:2) solvent sistemi ile ĐTK plakları üzerinde 2 biyoaktif spot (Rƒ 0,41 ve 0,46) tespit etmişlerdir. Aynı solvent sistemi kullanan Şahin ve

119

arkadaşlarının (2003) bazı Streptomyces izolatlarının antimikrobiyal aktivite çalışmalarda ĐTK plakları üzerinde 2 biyoaktif spot (Rƒ 0,60 ve 0,80) tespit etmişlerdir.

4.7. Minimum Đnhibisyon Konsantrasyon (MĐK)

Bir mikroorganizmanın gelişmesini en az düzeyde engelleyecek konsantrasyonu belirleme için izlenen yöntem pek çok araştırmada benzerdir. Ancak alınan sonuçlar açısından çalışmaların önemi değişmektedir.

Çalışmada 4 farklı bakteri ile (Staphylococcus aureus ATCC 25923, MRSA, VRE, Acinetobacter baumanii) Minimum Đnhibisyon Konsantrasyonu belirlenmiştir.

MĐK sonuçlarına göre, plaklarda farklı konsantrasyonlardaki kuyuculardan 100 µl alınarak petrilere aktarılmış ve inkübasyon sonunda Minimum Bakterisidal Konsantrasyon (MBK) belirlenmiştir. MĐK (MKB) değerleri; S. aureus 250 (>1000) µg/ml, MRSA 125 (1000) µg/ml, VRE 125 (1000) µg/ml, A. baumanii 125 (250) µg/ml olarak belirlenmiştir. Kontrol olarak kullanılan Streptomycin’e yakın sonuçların alınmış olması da dikkat çekici bir bulgudur.

Antimikrobiyal etkili maddenin en düşük hangi miktarda etkili olabildiğinin ve sidal etkisinin tespiti açısından MĐK ve MBK değerlerinin belirlenmiş olması önemlidir. Keza bir antibiyotiğin etki (veya dirençli olduğu dozun) dozunun belirlenmesi tıbbı açıdan da önemlidir.

Harindran ve arkadaşları (1999) Streptomyces CDRIL-312 tarafından üretilen yeni antibiyotik üzerine yaptıkları çalışmalarda, agar dilüsyon metodu ile dilüsyon serileri hazırlayarak “Minimum Đnhibisyon Konsantrasyon” belirlemişlerdir. MĐK çalışmaları sonucunda bazı bakteriler, mayalar, ipliksi mantarlar bitki ve klinik patojenlere karşı, test edilen standart antibiyotikler (Hamycin, Aureofungin, Amphotericin B, Griseofulvin) kadar umut verici sonuçlar almışlardır. Bakterilerde 5,0-75 µg/ml, bitki patojenlerine 0,5-1,5,0-75 µg/ml, maya ve mantarlara 0,1-2,0 µg/ml, klinik patojenlerde 0,1-5,0 µg/ml aralıklarında etkili olduğunu gözlemlemişlerdir.

Paradkar ve arkadaşları (1998) streptoverticillium sp ile yaptıklar çalışmalarda agar dilüsyon metodu ile bazı fungal ve bakteriyal organizmalara karşı MĐK

120

belirlemişlerdir. Bakterilerde 5,0-2,5 µg/ml, bitki patojenlerine 2,0-10,0 µg/ml, maya ve mantarlara 1,0-1,25 µg/ml aralıklarında etkili olduğunu gözlemlemişlerdir.

Yapılan çalışmalarla karşılaştırıldığında, yöntemin etkinliği açısından fikir vermektedir. Keza, MĐK Bir mikroorganizmanın gelişmesini en az düzeyde engelleyecek konsantrasyon olarak tanımlanır (Anonymus, 2007 d). Maddenin çok küçük konsantrasyonların mikroorganizmalar üzerinde etkili olması istenen sonuçtur çünkü bu maddenin etki derecesinin yüksek olduğunu ve mikroorganizmalar üzerinde yüksek duyarlılığa neden olduğunu göstermektedir. Çalışmamızda belirlediğimiz sonuçlarda bu anlamda umut vericidir.

4. 8. Aktif Molekülün Sıcaklık Toleransı

Bilgili (2005) yaptığı araştırmasında bu çalışma için kullandığı yöntem etkinliği açısından uygun görülmüş ve aynı yöntem araştırmamız içinde son deney olarak gerçekleştirilmiştir.

Çalışmamızda 60 °C’ de 30 dk ve 100 °C’ de 5 dk işlem gören antimikrobiyal etkili maddenin disk difüzyon ve MĐK yöntemleri kullanılarak sıcaklık toleransı belirlenmiştir. Disk difüzyon çalışmasında, 4 farklı bakteri sıcaklık uygulamasından önceki aktiviteye göre Staphylococcus aureus (ATCC 25923) % 33-42 oranında, MRSA

Çalışmamızda 60 °C’ de 30 dk ve 100 °C’ de 5 dk işlem gören antimikrobiyal etkili maddenin disk difüzyon ve MĐK yöntemleri kullanılarak sıcaklık toleransı belirlenmiştir. Disk difüzyon çalışmasında, 4 farklı bakteri sıcaklık uygulamasından önceki aktiviteye göre Staphylococcus aureus (ATCC 25923) % 33-42 oranında, MRSA