Akciğer kanseri klinik olarak çeşitli semptomlarla ortaya çıkan bir hastalıktır. Erken evrede belirtilerin hafif ve non-spesifik olması, genelde hastalara ileri evrede tanı konmasına neden olmaktadır. Düşük doz BT taraması, akciğer kanserinin erken evrede tespit edilmesi için kullanılmasına rağmen yanlış pozitiflik, radyasyon maruziyeti, zaman ve emek kaybı, maliyet gibi dezavantajları sebebiyle akciğer kanserinde yeni erken tanı araçlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Vücut sıvılarındaki moleküler biyomarkerların, non-invaziv alternatif tanı yöntemleri olarak kullanılması, akciğer kanserinin erken tanısında, prognozunda ve hastanın tedaviye yanıt vermesinde yardımcı olmaktadır (3). Son yıllarda periferik kandan elde edilen cfDNA’daki epigenetik değişiklikler bu amaçla kullanılan biyomarkerlar arasında önem kazanmıştır (50).
Çalışmamızda, ileri evre KHDAK’li hastalardan ve sağlıklı kontrollerden alınan periferik kandan elde edilen plazmadaki cfDNA’da önceden belirlenmiş altı genin metilasyonu droplet dijital PCR yöntemi ile kantitatif olarak değerlendirilmiştir. Onar kişilik hasta ve kontrol grubundan oluşan çalışmamızda sayının az olması sebebiyle subklinik akciğer ilişkili karsinogenezi dışlamak için kontrol grubu sigara içmeyen ve ek hastalığı olmayan kişilerden seçilmiştir. Yine aynı sebeple hasta grubu metilasyonu saptamak amacıyla ileri evre KHDAK’li hastalardan seçilmiştir. Çalışmamız, cfDNA’da belirli genlerde metilasyon ölçümünün akciğer kanserinde klinik erken tanı biyomarkerı olarak kullanımının tartışıldığı Türkiye’deki öncü çalışmalardandır.
Akciğer kanseri tüm dünyada erkeklerde en sık, kadınlarda da meme kanserinden sonra en sık görülen kansere bağlı ölüm sebebidir. Her iki cinsiyette de akciğer kanseri tanısındaki ortalama yaş 70’tir. Tüm hastaların yaklaşık %10'u 55 yaşından küçük, %53’ü 55-74 yaşlarında ve %37'si 75 yaş ve üstüdür (51). Akciğer kanseri, KHDAK (hastaların %80’i) ve küçük hücreli akciğer kanseri (hastaların %20’si) olarak iki gruba ayrılmaktadır. Tüm akciğer kanserlerinin %40’ı adenokarsinom, %20’si skuamöz hücreli karsinomdur (52). Çalışmamıza alınan 55-80 yaş arası (ortalama 67,0±9,0) 5 erkek ve 5 kadın KHDAK’li hastanın 7’si (%70) adenokarsinom, 3’ü (%30) skuamöz hücreli karsinom tanısı almıştır. Daha fazla sayıda KHDAK’li hastalarla yapılan çalışmalarda adenokarsinom sıklığı %60-90, skuamöz hücreli karsinom sıklığı %13-17 olarak bulunmuştur (53).
Sigara akciğer kanseri gelişimi ile en çok ilişkili risk faktörüdür. Nikotinin kendisi kanserojen olmamakla birlikte, sigara dumanında bulunan kanserojen kabul edilen 55 kadar madde; DNA eklentilerinin oluşumuna, gen metilasyonlarına, DNA sekansında değişikliklere,
DNA segmentlerinde delesyonlara veya duplikasyonlara, tüm kromozom kazançlarına veya kayıplarına yol açar. Sigara içmeyenlere kıyasla sigara içenlerde göreceli akciğer kanseri risk artışı 10-30 kat arasında değişmektedir ve risk derecesi günlük ve yıllık sigara kullanım miktarına bağlıdır (22). Yapılan çalışmalarda pasif sigara içiciliğinin de sigara içmeyenlerde akciğer kanseri riskini yaklaşık 2 kat arttırdığı gösterilmiştir (54). Çalışmamızda 10 hastamızın 7’si en az 20 yıl/paket sigara kullanmıştır. 1 kadın hastamızın sigara kullanma öyküsü yoktur, ancak eşinin sigara kullanımı nedeniyle 20 yıl pasif içicilik öyküsü mevcuttur. 2 kadın hastamızın sigara kullanım öyküsü, ek hastalığı ve anamnezde akciğer kanseri için ek risk faktörü maruziyeti bulunmamaktadır.
Daha önce sigara içmeyen kişilerde akciğer kanseri tanısı erkeklere kıyasla kadınlara daha fazla konmaktadır. Sigara kullanmamış akciğer kanseri hastalarında en sık adenokarsinom histolojisi görülmekle birlikte nadir de olsa skuamöz hücreli karsinom da görülebilmektedir (55). Bizim çalışmamızda sigara maruziyeti olmayan 2 kadın hastamızın birine adenokarsinom, diğerine skuamöz hücreli karsinom tanısı konmuştur.
Akciğer kanserli hastaların birinci derece akrabalarında akciğer kanseri riskinin 1,88 kat daha yüksek olduğu önceki çalışmalarda bulunmuştur (56). Genom boyu ilişkilendirme çalışmalarında tanımlanan akciğer kanseri duyarlılık lokuslarının, etiyolojik ajanlara maruziyet sonrası bu ajanlara karşı bireysel yanıtla ilişkili olduğu gösterilerek bu risk artışının sebebi gösterilmiştir (57). Bizim çalışmamızda 1 kadın hastamızın erkek kardeşi akciğer kanseri nedeniyle ölmüştür. Diğer hastalarımızın birinci derece akrabalarında akciğer kanseri öyküsü bulunmamaktadır ancak bir hastamızın erkek kardeşinde bazal hücreli cilt karsinomu, bir diğer hastamızın dedesinde malign melanom, diğer bir hastamızın da amcasında ve yeğenlerinde kolon ve prostat kanseri gibi farklı kanserler olduğu görülmüştür.
Akciğer kanserinde mortalite oranı erkeklerde kadınlara göre daha fazladır ve prognoz kadınlara göre daha kötüdür (58). Çalışmamızda alınan hastalarda 1 erkek hasta tanıdan 3 ay sonra, başka bir erkek hasta tanıdan 8 ay sonra, 1 kadın hastamız ise tanıdan 7 yıl sonra ölmüştür. Ölen hastalarımızın 2’si adenokarsinom, 1’i skuamöz hücreli karsinom tanılıdır. Adenokarsinomun skuamöz hücreli karsinomdan daha kötü prognozlu olduğu önceki çalışmalarda gösterilmiştir (24).
Son yıllarda, dolaşımdaki cfDNA’nın, onkolojik hastalıklarda potansiyel biyomarker olarak kullanımı ile ilgili çalışmalar artmıştır. Enflamasyon, doku travması ve kanser de dahil olmak üzere artan cfDNA konsantrasyonları çeşitli durumlar ile ilişkilendirilebilir. Kanserli hastalarda, cfDNA'nın önemli bir kısmı tümör hücrelerinden gelmektedir ve cfDNA
konsantrasyonu tümör yükünü yansıtmaktadır. Ayrıca, cfDNA dolaşımdaki tümör hücrelerinden de kaynaklanabilir ve bu nedenle mikro-metastatik hastalığı ve hastalığın agresiflik potansiyelini de yansıtabilmektedir. Bu nedenle cfDNA konsantrasyonunun, hem tümörün tedaviye verdiği yanıtının değerlendirilmesi hem de prognostik bir faktör olarak klinikte kullanımı daha önce yapılan çalışmalarda araştırılmıştır (59).
Çalışmamızda, cfDNA konsantrasyonu akciğer kanserli hastalarda ortalama 0,771±1,255 ng/ul (771 ng/ml), sağlıklı kontrollerde ortalama 1,351±1,035 ng/ul (1351ng/ml) olarak bulunmuştur (p<0,05). Kanserli hastalarımız düzenli takibi yapılan, kemoterapi ve/veya radyoterapi tedavisi alan hastalardır. Çalışma için örnek alımı tedavileri sırasında yapılmıştır. Yapılan çalışmalara bakıldığında, Tissot ve ark. 218 KHDAK’li hastada yaptıkları çalışmada tedavi öncesi ve tedavi sonrası konsantrasyon farkının anlamlı olmadığını ve cfDNA konsantrasyonunun 2.54 ng/ml ile 6451,36 ng/ml arasında değiştiğini belirtmişlerdir (59). Ludovini ve ark. akciğer kanseri olan 76 hastada (ortalama 60 ± 99.8ng/ml) 66 kontrole (ortalama 6 ± 8.8 ng/ml, P <0.0001) kıyasla plazma cfDNA düzeylerinin anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir (60). Newman ve ark. ise, cfDNA'nın tümör yükündeki değişikliklerle ilişkili olduğunu bulmuşlardır. Çalışmalarında cfDNA, tümör hacmi ile yüksek korelasyon göstermiş ve cfDNA seviyelerinin ölçümü, rezidüel hastalığı saptamada radyografik yaklaşımlardan daha erken evrede değerlendirme sağlamıştır (8). Diğer kanserlerde yapılan çalışmalarda da cfDNA seviyelerindeki yüksekliğin tümör yükünü yansıttığı gösterilmiştir (61,62). Çalışmamızda hasta grubundaki cfDNA konsantrasyonunun kontrol grubuna göre anlamlı derecede düşük olma sebebinin hastaların tedavi alması nedeniyle tümör yükündeki azalma olabileceği düşünülmektedir. Yine de akciğer kanserinde tümör yükü ile cfDNA konsantrasyonu arasındaki ilişkinin anlaşılabilmesi için daha yüksek sayıda hasta grubu ile tedavi öncesi ve sonrasında yapılacak ölçümlere ihtiyaç vardır.
cfDNA konsantrasyonu ve kanser karakteristiği ile ilgili yapılan çalışmalardaki karşılaştırmalarda cfDNA konsantrasyonu ve tümör mutasyonları arasında anlamlı ilişki bulunamamıştır (61,63). Bununla birlikte, Liebs ve ark.’nın kolorektal kanserde ddPCR ile yaptıkları çalışmada cfDNA konsantrasyonunun artmasıyla mutasyon saptama oranının arttığı gösterilmiştir (64). Çalışmamızda da bunu destekler nitelikte, 6 genin metilasyon değerlerinin cfDNA ile karşılaştırılmasında, hastalarda SHOX2 ve DAPK1 genleri metilasyon değerleri ile cfDNA konsantrasyonu arasında anlamlı korelasyon bulunmuştur (p<0,05).
DNA metilasyonunun diğer biyomarkerlardan farklı olarak en önemli özelliği dokuya özgü olmasıdır. Farklı doku tiplerinden kaynaklanan kanserlerin benzer genotipleri olmasına rağmen metilasyon profilleri çeşitlilik gösterir; dolayısıyla kansere özgü metilasyon imzaları,
primer kanser dokusunu tanımlamak için kullanılabilir. Hücre tipleri, cfDNA'nın doku kökenine spesifik farklı DNA metilasyon modellerine sahiptir (65,66). cfDNA metilasyonu, kanserde hem primer tümörün durumunu değerlendirme hem de metastazların özelliklerini belirleme amacıyla da kullanılabilmektedir. Picardo ve ark.’nın yaptığı çalışmada kolorektal kanserli 37 hastanın primer tümör dokusu, metastaz dokusu ve cfDNA örneklerinde B4GALT1 geninin metilasyon durumuna bakılmış ve cfDNA’daki metilasyon değişikliklerinin primer tümör dokusunu değil, metastaz dokusunu yansıttığı gösterilmiştir (67). Dvorska ve ark.’ları 128 over-meme kanserli doku ve plazma cfDNA örneği ile yaptıkları çalışmada ise doku örneklerinde iki gende (CDH1 ve PAX1) kontrol grubuna göre anlamlı fark saptanırken, plazma örneklerinde sadece CDH1 geninde anlamlı metilasyon farkı saptanmıştır (68). Liu ve ark.’nın 5 yıl boyunca, akciğer adenokarsinomu dahil olmak üzere 32 farklı kanser tipinde tedavi gören hastalarla yaptıkları çalışmada, cfDNA ve doku DNA metilasyon değerlerinde kolorektal kanserler dışında korelasyon saptanamamıştır (66). Çalışmamızda üç hastanın daha önce biyopsi ile alınmış FFPE tümör dokusundan elde edilen DNA’da altı genin metilasyon paternine bakılmıştır. Sayının az olması sebebiyle istatiksel analiz yapılamasa da kontrol, hasta ve doku metilasyon değerlerinin ortalamaları ile çizilen grafiklerde; DAPK1, SHOX2, RASSF1A, p16 genlerindeki doku DNA metilasyon ortalamalarının cfDNA ortalamaları ile korelasyon gösterdiği görülmüştür. DAPK1, SHOX2, RASSF1A genlerinde hastalarda dokudaki metilasyon değeri ortalamalarının cfDNA’dan daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Bu hastalarda dokudan elde edilen DNA konsantrasyonunun cfDNA konsantrasyonundan fazla olması sebebiyle üç gende doku metilasyon değerlerinin cfDNA’dan daha yüksek ölçüldüğü düşünülmektedir. Bununla birlikte çizilen grafiklerde; APC ve RARβ2 genlerinde cfDNA ve doku metilasyon ortalamaları arasında korelasyon gözlenememiştir. p16 geninde de hastalarda dokudaki metilasyon ortalaması cfDNA’dan daha az saptanmıştır. Ayrıca üç hastanın cfDNA ve doku DNA metilasyon değerleri ile çizilen karşılaştırmalı grafiklerde de farklı seyirler gözlenmiştir. Dolayısıyla, cfDNA’daki metilasyonun dokuya spesifik metilasyon değerleri ile karşılaştırmasını yapmak için daha fazla sayıda örneğin analizine ihtiyaç duyulmaktadır.
ddPCR, kopya sayısının mutlak miktarını elde etmek için kullanılan ve nadir bir varyantın tespit sınırını % 0.01'e kadar düşürebilen üçüncü nesil bir PCR teknolojisi olarak kabul edilmektedir (69). Bununla birlikte Sanger sekanslama, bir genin promotor bölgesi veya bir CpG adası gibi hedef bölgelerin metilasyon analizi için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir (70). Teorikte, Sanger sekanslama, % 25'in altındaki düşük frekans değişikliklerini kolayca tespit edemediğinden, düşük frekanslı mutasyonları saptama başarısı sınırlıdır (69). Wang ve ark.’nın 120 tiroid kanseri hastası ile yaptığı çalışmada ddPCR ve Sanger sekanslamanın performası karşılaştırılmıştır ve mutasyon oranı <%5 olduğunda ddPCR’ın
Sanger sekanslamadan daha başarılı olduğu tespit edilmiştir (71). Çalışmamızda hedef gen bölgelerinin bisülfit dönüşümünden sonra yapılan Sanger sekanslamada unmetile ve metile pikler çoğu örnekte çok net görülmüştür. Bununla birlikte, ddPCR analizinden elde edilen sonuçlarda, Sanger sekanslamada unmetile olarak saptanan örneklerde de metilasyon amplifikasyonu saptanmıştır. Literatürle uyumlu olarak bizim çalışmamızda da, ddPCR’ın hassasiyeti yüksek bir sistem olduğu için, metile ve unmetile allellerin fraksiyonunun çok az da olsa analiz edilebileceği düşünülmektedir.
Akciğer kanserli 127 hastanın cfDNA metilasyon değerlerine bakıldığı bir çalışmada; yaş, cinsiyet, histolojik alt tip arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır (72). Çalışmamızda da ddPCR ile ölçülen metilasyon değerleri analiz edildiğinde cinsiyetle anlamlı ilişki bulunamamıştır. 10 hasta örneğinin 7’si adenokarsinom, 3’ü skuamöz hücreli karsinomdur. Sayının az olması sebebiyle istatiksel analiz yapılamamıştır ve aynı şekilde grupların yaş ortalamaları yakın olduğundan yaşla metilasyon değeri ilişkisi analiz edilememiştir. Sonraki çalışmalarda histolojik alt tip ve yaşın analiz edilebilmesi için daha fazla sayıda hastayı kapsayan heterojen bir hasta grubuna ihtiyaç vardır.
Çalışmamızda 6 genin metilasyon değerleri hasta ve kontrol grubunda karşılaştırıldığında, hasta grubunda DAPK1 geninde kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek metilasyon değeri saptanmıştır (p:0,017). Diğer 5 gende gruplar arasında anlamlı istatiksel farklılık saptanamamıştır.
DAPK (death-associated protein kinase, ölümle ilişkili protein kinaz) gen ailesi üyeleri (DAPK1, DAPK2, ZIPK, DRAK-1 ve DRAK-2) fonksiyonları çok çeşitli olan beş serin/treonin protein kinazı kodlamaktadır. Bu protein kinazlar serin, treonin, tirozin, histidin, arjinin, lizin, glutamik asit veya aspartik asit kalıntılarını değiştirmek için substrat proteinlerine fosfat grupları ekleyerek etki ederler. Böylece, neredeyse tüm hücresel süreci düzenleyerek birçok proteinin aktivitesini, lokalizasyonunu ve genel fonksiyonunu yönlendirirler. DAPK’lar; ölüm reseptörleri, sitokinler, matris ayrılması ve hiper-proliferasyon tarafından üretilenler dahil olmak üzere çoklu ölüm sinyalleri ile hücre ölümünün indüklenmesi için gerekli protein kinazlardır. DAPK gen ailesinden, DAPK1 ve DAPK2 genlerinin ekspresyonu birden çok kanser türünde azalmaktadır (73).
DAPK1 protein kinazı, ilk olarak 1990'larda Hela hücrelerinde interferon (IFN) kaynaklı hücre ölümünde fonksiyonel bir aracı olarak keşfedildi (74). Büyük bir C-terminal uzantısına sahip olduğundan 160 kDa moleküler ağırlığı ile DAPK protein kinazlarının en büyüğüdür. C-terminalinde, diğer DAPK'larda olmayan ve birçok apoptoz ilişkili proteinde
yaygın olan bir ölüm alanı içermektedir (75). Kalsiyum kalmodulin kompleksi tarafından regüle edilen DAPK1, p53 bağımlı/bağımsız veya otofajik hücre ölümü yolaklarını tetikler (76). Çalışmalar, TNF-α ve IFN-γ’nın neden olduğu DAPK1 aracılı hücre ölümü mekanizmalarını ortaya koymuştur; DAPK1, nükleer faktör kappa β (NF-κβ) sinyal yolları üzerinden TNF-α ve IFN-γ’nın proapoptotik aktivitesine aracılık etmektedir. Ayrıca DAPK1, Fas ligand gibi bir çok iç ve dış apoptotik ajanla da indüklenebilir (73).
Homozigot/heterozigot delesyonlar, nokta mutasyonları, miRNA aracılı down regülasyon sebepleriyle DAPK1 ekspresyonu zayıflamasına rağmen DAPK1'nin kanserdeki esas inaktivasyon mekanizması, geninin promotorundaki hipermetilasyondur. DAPK1 geninin 5-UTR'si, hipermetilasyonla gen susturulmasına ve ekspresyon kaybına yol açan bir CpG adası içermektedir (73,76). Klasik bir anti-onkogen olarak DAPK1'in, tümörlerin gelişimi, ilerlemesi ve metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. DAPK1 ekspresyonunun azalması, akciğer kanseri dahil olmak üzere çeşitli kanserlerde malignitenin şiddeti ve lenf nodu metastazı ile ilişkili bulunmuştur (74).
Metilasyon geri dönebilen bir süreç olduğundan, tedavide DNA'yı demetile edebilen ajanlar (5-azasitidin ve 5-aza-2-deoksisitidin (Decitabine)) geliştirilmiştir ve test edilmiştir. DAPK1'in tümörlerde demetilasyon yoluyla yeniden ekspresyonunun, potansiyel bir ilaç hedefi olarak klinik yarar sağlayabileceğini gösteren çalışmalar vardır (76). DAPK1 geninin Decitabine ile tedavi sonrası demetilasyonunun, DAPK1 ekspresyonunu ve hücrenin IFN-γ’ya karşı apoptotik duyarlılığını geri kazandırdığı gösterilmiştir (73).
DAPK1 geninin metilasyonu çeşitli tümörlerde bulunmasına rağmen, tümörler arası metilasyon sıklığında büyük bir fark vardır. Akciğer kanserinde DAPK1 disfonksiyonu, yüksek metilasyon sıklığı (ortalama % 40,5) ve prognostik etkileri nedeniyle tümör patogenezinde önemlidir (76). Russo ve ark.’nın yaptığı çalışmada sigara içenlerde bronş epitelinde DAPK1 metilasyonunun arttığı bulunmuştur (77). Kim DH ve ark.’nın 85 KHDAK’li hastanın dokusunda DAPK1 metilasyonunu inceledikleri çalışmada, artmış metilasyonun ileri evre akciğer kanserinde lenf nodu metastazı ve tümör büyümesi ile ilişkili olduğu bulunmuştur (78). Dokudan yapılan başka bir çalışmada, 61 KHDAK’li hastanın tedavisinde DAPK1 demetilasyonunun tedavi yanıtında prognostik marker olarak kullanılabileceği gösterilmiştir (79). 72 akciğer adenokarsinomlu hastada yapılan bir çalışmada ise kanser dokusunda DAPK1 metilasyon artışının hayatta kalma süresini kısalttığı saptanmıştır (80). Yine farklı çalışmalarda KHDAK tedavisinde kullanılan EGFR inhibitörlerine karşı gelişen dirençte, hastalardaki DAPK1 hipermetilasyonun kilit rol oynadığı gösterilmiştir (81,82). Ayrıca literatürde akciğer
kanserli hastalarda cfDNA’daki DAPK1 hipermetilasyonunun erken tanıda potansiyel biyomarker olarak kullanılabileceği yer almaktadır (83).
Çalışmamızda yapılan ROC analizinde DAPK1 geni için sensivite 0,8 ve spesivite 1,0 olarak saptanmıştır. Literatürdeki DAPK1 geninin metastaz ve kötü prognoz ile ilişkili olduğu bilgisiyle uyumlu olarak, anlamlı DAPK1 hipermetilasyonu olan 8 hastamızın hepsinde yaygın metastaz mevcuttur ve 2 hastamız tanıdan kısa bir süre sonra ölmüştür. Skuamöz hücreli karsinom tanılı 7 numaralı hastamız, tanıdan 3 ay sonra ölmüştür. Hastamızın hem dokudan (0,82) hem de cfDNA’dan (0,622) bakılan DAPK1 metilasyon değerleri diğer hastalar arasındaki en yüksek değerlerdir. Çalışmamızda ölen 3 hasta arasında, skuamöz hücreli karsinom tanısı nedeniyle adenokarsinoma göre daha iyi prognozlu olması öngörülmesine rağmen tanıdan sonra en kısa sürede ölen hastamızda DAPK1 metilasyon değerlerinin en yüksek olması, bu gendeki yüksek metilasyonun hasta prognozunu kötü etkilemiş olabileceğini düşündürmektedir.
Çalışmamızda genler arası korelasyon analizinde SHOX2 ve p16 genleri arasında anlamlı korelasyon saptanmıştır. Örnek sayımızın az olması sebebiyle bu genlerin DAPK1 ile birlikte biyomarker paneli olarak kullanılabilirliği analiz edilememiştir. Ancak daha fazla sayıda hasta ile yapılacak çalışmalarda bu üç gende anlamlı ilişki bulunabileceği düşünülmektedir. Nitekim birçok çalışmada SHOX2 (11, 82–84) ve p16 (87–89) hipermetilasyonunun akciğer kanseri ile ilişkisi gösterilmiştir.
Çalışmamızda yapılan analizlerde örnek sayısının az olması sebebiyle bazı sonuçlar klinikle net olarak ilişkilendirilememiş olsa da DAPK1 geninde hasta ve kontrol grubu arasındaki anlamlı metilasyon farklılığı çalışmamızın en önemli bulgusu olmuştur. Dolayısıyla, cfDNA metilasyonu-kanser ilişkisini araştırmak için daha fazla sayıda örnekle yapılacak çalışmalarda istatiksel analizlerin klinik yorumunun daha net ortaya konulması mümkündür.