Tanıtım

As concentrações de leptina e OB-Re foram determinados por meio da técnica de ensaio imuno-enzimático, utilizando-se kits comerciais de ELISA (Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Califórnia, EUA), seguindo as devidas recomendações dos fabricantes. O ensaio imuno- enzimático é uma ferramenta para detectar peptídeos específicos baseado no princípio da competitividade enzimática.

Para as dosagens de leptina as placas apresentaram-se previamente revestidas com um anticorpo de captura humano e com os sítios de ligação não específicos bloqueados. A proteína da amostra ou da solução padrão se uniu ao anticorpo de captura nos poços. Após os precedimentos de lavagem o biotinilado foi adicionado. Após nova lavagem a AS-HRP catalisou o substrato. A reação enzima-substrato foi cessada por meio da adição da solução de interrupção. A intensidade da cor é diretamente proporcional à quantidade do peptídeo da amostra ou da solução padrão. Uma curva padrão de concentração conhecida foi estabelecida.

As concentrações desconhecidas das amostras foram então determinadas por extrapolação desta curva padrão. A sensibilidade dos kits foi de 0,5 ng/mL para leptina.

A dosagem das concentrações de OB-Re no plasma foram realizadas com kits de Ensaio Imunoenzimático (ELISA) seguindo as recomendações do fabricante (Phoenix Pharmaceuticals®, Burlingame, CA, Estados Unidos). As amostras de plasma foram diluídas (1:2) com o tampão específico do kit. As placas foram incubadas a 37 °C por 90 minutos e a seguir foram realizadas 3 lavagens. A seguir, as placas foram incubadas a 37°C por 30 minutos com anticorpo monoclonal marcado com peroxidase. Após os novos precedimentos de lavagem, as placas foram incubadas a 37°C no escuro por 15 minutos com Tetra-metil- benzidina (TMB). A seguir, 100 μL de solucão de interrupção foi adicionada em cada well e a leitura da absorbância foi realizada a 450 nm. A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de OB-Re na amostra. As concentrações das amostras foram então determinadas por extrapolação da curva padrão.

6.2.3 Cálculo do FLI

O FLI foi calculado pela fórmula: FLI = concentração de leptina (ng/mL) /

concentrações de OB-Re (ng/mL) (ROSZKOWSKA-GANCARZ et al., 2015; WONG et al.,

2004).

6.2.4 Análise estatística

Inicialmente foi realizada a análise da normalidade dos dados utilizando o teste Komolgorov-Smirnov. Em seguida, foi realizada uma análise descritiva para a determinação das médias e dos erros-padrão (±EP). Nas análises de OB-Re e FLI, foram calculadas as médias (±EP) dos seis pontos coletados durante o período de 24 horas. A ANOVA one-way foi utilizada para comparar as características dos indivíduos e o teste de post-hoc de Tukey foi utilizado para verificar as diferenças significativas. A Mixed-model ANOVA foi construída para verificar as modificações nos níveis de OB-Re e FLI durante as 24 horas nos diferentes grupos (random-effect term, grupo; fixed-effect term, tempo; fixed-effect term, medidas repetidas). O teste tipo III de efeitos fixos foi realizado para verificar a significância de qualquer efeito sobre OB-Re e FLI. Foi realizada análise pos hoc com correção de Bonferroni para encontrar diferenças significativas. A análise estatística foi realizada usando o software SPSS 23 e foram considerados significativos valores com p-value ≤ 0,05.

7. RESULTADOS

A caracterização dos voluntários do estudo de acordo com os turnos de trabalho (GM, GN e GD) é apresentada na tabela 1. Não foram verificadas diferenças entre os grupos em relação à idade, tempo de trabalho em turnos, nível de atividade física e variáveis antropométricas quando os três turnos de trabalho foram comparados (p>0,05). Os grupos diferiram apenas em relação a duração habitual do sono (p=0,05), que foi maior para o GM.

Tabela 1 - Idade, tempo de trabalho em turnos, variáveis antropométricas, duração do sono e nível de atividade física dos trabalhadores em turnos (GM e GN) e diurnos (GD)

GD (n = 7) GM (n = 6) GN (n = 9)

Média _{EP Média EP Média EP p*}

Idade (anos) 26,7 2,6 31,8 1,5 30,1 1,4 0,20

Tempo de trabalho em turnos (anos) 2,9 1,1 3,7 0,58 4,2 0,8 0,45

Estatura (metros) 1,7 0,02 1,7 0,03 1,8 0,02 0,54

Massa corporal (kg) 82,6 3,9 79,8 3,9 80,4 4,0 0,07

Índice de Massa Corporal (kg/m²) 27,2 1,0 27,6 1,16 26,1 1,4 0,20

Massa gorda (%) 22,4 1,9 21,7 2,2 21,3 2,6 0,21

Circunferência da cintura (cm) 91,4 2,9 92,7 3,2 89,5 3,2 0,07

Duração total do sono (min) 341,8b _{17,6 413,2}a _{16,4 350,9}b _{20,5 0,05}

Nível de atividade física 2,7 0,4 2,8 0,4 2,8 0,3 0,86

Nota: Valores expressos em média (±EP). Valores com diferentes letras sobrescritas são significativamente diferentes (a ≠ b); p ≤ 0,05. *Diferenças entre os turnos foram calculadas com o uso da ANOVA e teste post-hoc de Tukey.

A tabela 2 apresenta as concentrações médias em 24 horas de OB-Re e FLI médio para os três grupos estudados. Não foram observadas diferenças significativas nesses parâmetros quando os turnos de trabalho foram comparados (p>0,05).

A ANOVA Mixed-model (Tabela 3) indicou um efeito significativo do turno de trabalho sobre as concentrações de OB-Re

Tabela 3 - Testes tipo III dos efeitos fixos do receptor solúvel de leptina (OB-Re) e índice de leptina livre (FLI)

Variável Efeito GL Numerador GL Denominador F p*

Ob-Re Tempo 5 33,32 0,66 0,65 Turno 2 105,87 8,45 <0,005 Turno x tempo 10 33,32 0,29 0,97 FLI Tempo 5 31,01 2,18 0,08 Turno 2 76,25 2,23 0,11 Turno x tempo 10 31,01 0,70 0,71

Nota: *p values calculado pela ANOVA Mixed-model. GL=Graus de liberdade.

A comparação post hoc com correção de Bonferroni (Tabela 4) foi realizada para o fator turno e mostrou que os trabalhadores diurnos apresentavam níveis mais elevados de OB- Re do que o GM (diferença média ± EP = 4,74 ± 1,26; GL = 105,87; p=0,001) e o GN (diferença média ± EP = 3,80 ± 1,14; GL = 105,87; p=0,004). Não foram observados efeitos do tempo (p=0,65) ou da interação entre turno x tempo (p=0,97) nas concentrações de OB-Re.

Não foi observado efeito significante do tempo (p=0,08), turno (p=0,11) e interação turno x tempo (p=0,71) para os valores de FLI.

Tabela 2 - Média em 24 horas das concentrações plasmáticas de OB-Re e do FLI dos trabalhadores em turnos (GM e GN) e diurnos (GD) GD (n = 7) GM (n = 6) GN (n = 9)

Média EP Média EP Média EP p*

Receptor solúvel de leptina (OB-Re)

Valor médio em 24 horas, ng/mL 23,2 2,3 18,4 0,98 19,4 1,8 0,21

Índice de leptina livre- FLI

Valor médio em 24 horas 0,16 0,09 0,25 0,07 0,24 0,06 0,64

Tabela 4 - Comparação post hoc para o fator turno do receptor solúvel de leptina (OB-Re) (I) Turno (J)Turno Diferença

Média (I-J)

EP GL p 95% Intervalo de

Confiança para a diferença Limite Inferior Limite Superior GD GM 4,774* 1,263 105,868 0,001 1,701 7,847 GN 3,800* 1,144 105,868 0,004 1,016 6,583 GM GD -4,774* 1,263 105,868 0,001 -7,847 -1,701 GN -0,974 1,197 105,868 1,000 -3,885 1,937 GN GD -3,800* 1,144 105,868 0,004 -6,583 -1,016 GM 0,974 1,197 105,868 1,000 -1,937 3,885

Nota: *p calculado pela ANOVA Mixed-model. Comparação post hoc para o fator turno: GD tiveram maiores níveis de OB-Re do que o GM (diferença média ± EP [erro padrão] = 4,74 ± 1,26; GL (graus de liberdade) = 105,87; p=0,001) e GN (diferença média ± EP = 3,80 ± 1,14; GL = 105,87; p=0,004).

Os perfis diários das concentrações médias de OB-Re e dos valores de FLI nos seis pontos analisados (8:00h, 12:00h, 16:00h, 20:00h, 24:00h e 4:00h) para trabalhadores em turnos (GM e GN) e diurnos (GD) são apresentados na figura 7.

Figura 7: Média (±EP) das concentrações de OB-Re e do FLI nos seis pontos de avaliação em trabalhadores em turnos (GN e GM) e diurnos (GD) e os respectivos horários de sono para cada grupo.

8. DISCUSSÃO

Este estudo avaliou as concentrações médias de OB-Re e FLI em trabalhadores em turnos (GM e GN) e diurnos (GD). Ao realizar a ANOVA Mixed model foi encontrado um efeito significativo do turno sobre as concentrações de OB-Re, com o GD apresentando níveis mais elevados do receptor em relação ao GM (p=0,001) e GN (p=0,004). Estes resultados sugerem que a liberação de OB-Re pode ser influenciada pelo turno de trabalho. Dessa maneira, torna-se importante elucidar se esses resultados podem contribuir para a alta prevalência de distúrbios metabólicos encontrados entre trabalhadores em turnos (AXELSSON; PUTTONEN, 2012; GUO et al., 2015).

Neste estudo verificamos que as concentrações médias em 24 horas de OB-Re e FLI não diferiram significativamente entre os grupos (Tabela 2). Apesar disso, é importante se atentar aos níveis médios de OB-Re e FLI, uma vez que evidências têm apontado que pode haver aumento ou redução nos níveis de OB-Re e FLI de acordo com a situação metabólica do indivíduo. A obesidade, por exemplo, está associada a uma redução significativa dos níveis de OB-Re e um aumento no FLI (VAN DIELEN et al., 2002).Em resumo, é possível inferir que níveis ótimos de OB-Re e FLI são importantes para a homeostase energética.

Este foi o primeiro estudo que encontrou um efeito significativo do turno de trabalho sobre as concentrações de OB-Re (Tabelas 3 e 4), mostrando um perfil de secreção distinto (Figura 7) para trabalhadores em turnos (indivíduos usualmente dessincronizados) em comparação com indivíduos que trabalham em horários regulares (possuem um ritmo biológico mais ajustado). Shea et al. (2005) enfatizam que fatores comportamentais externos – tais como o ciclo sono/vigília e a ingestão alimentar - poderiam exercer um efeito importante sobre as concentrações de OB-Re ao longo do dia. Assim, o diferente padrão de secreção de OB-Re entre trabalhadores em turnos poderia ser resultado da influência de fatores comportamentais, que são frequentemente alterados pelo trabalho em turnos, explicando assim o efeito significativo do turno sobre a secreção de OB-Re. Esse perfil diferenciado de secreção de OB-Re verificado entre trabalhadores em turnos poderia, por exemplo, ser induzido por alterações no ciclo sono/vigília e ingestão alimentar, o que poderia influenciar o apetite, a ingestão alimentar e o balanço energético nessas populações, tendo implicações importantes no aumento da obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares nesses trabalhadores (LAJOIE et al., 2015; PAN et al., 2011; PEPLONSKA; BUKOWSKA; SOBALA, 2015).

A manutenção de um perfil de secreção de OB-Re é importante na modulação da ação da leptina, uma vez que a ação da leptina sobre o sistema nervoso central é relevante para a regulação fisiológica da ingestão alimentar, balanço energético e função neuroendócrina (WONG et al., 2004). O receptor OB-Re pode desempenhar um papel significativo na determinação dos níveis de leptina total e leptina livre, bem como na atividade biológica da leptina. Então, é possível postular que alterações no perfil diário desse receptor poderiam afetar as funções desempenhadas pela leptina em trabalhadores em turnos (SCHAAB et al., 2012; TU et al., 2008).

Uma grande fração de leptina circula no plasma sob a forma de um complexo leptina- OB-Re, que é formado por meio de ligações dissulfeto/sulfidrilo (HOUSEKNECHT et al., 1996). A formação desse complexo permite aumentar a meia-vida da leptina e modular sua ação nas células alvo (YANG et al., 2004). A leptina, por apresentar um peso molecular de apenas 16 kDa, pode ser mais rapidamente eliminada ou metabolizada do que a leptina ligada a uma proteína de ligação que resulta em um complexo de 300 kDa (CHAN et al., 2002). Assim, verificamos que uma importante função do OB-Re é atrasar o depuramento de leptina da circulação e, consequentemente, aumentar a sua biodisponibilidade (HOUSEKNECHT et al., 1996; HUANG; WANG; LI, 2001; SINHA et al., 1996).

Além disso, OB-Re pode competir diretamente com os receptores de membrana pelo ligante (HUANG; WANG; LI, 2001). Quando a leptina está ligada ao seu receptor solúvel, o complexo OB-Re-leptina não é capaz de ativar o receptor OB-Rb (YANG et al., 2004). Ao comparar a capacidade de uma quantidade fixa de leptina ativar OB-Rb, verifica-se que a transdução do sinal de OB-Rb estimulada por leptina é reduzida na presença do receptor solúvel. Isso sugere que OB-Re “sequestra” a leptina, evitando assim a ligação ao seu receptor de sinalização OB-Rb e, com isso, tal hormônio fica temporariamente “inativo” (GE et al., 2002; YANG et al., 2004). Essa regulação dos níveis de leptina livre é importante na modulação da ação da leptina nas células alvo.

A leptina, hormônio polipeptídeo secretado pelos adipócitos em proporção ao seu teor de triglicerídeos, informa mudanças nas reservas de gordura corporal para que ocorra as devidas respostas adaptativas no controle central do balanço energético (PARK; AHIMA, 2015; SCHWARTZ et al., 2000). Ao ligar-se e ativar a forma longa do seu receptor (OB-Rb) no cérebro, a leptina reduz a ingestão alimentar enquanto aumenta o gasto energético (WADA et al., 2014). Portanto, é necessária a ação da leptina para que as reservas de energia sejam detectadas pelo SNC, fato essencial para homeostase energética, reprodução, etc. (MYERS et al., 2010). Alterações nos níveis diários de leptina circulante desempenham um papel

importante na patogênese da obesidade e síndrome metabólica (CHAPUT et al., 2007; ROSENBAUM et al., 2002; SPIEGEL et al., 2004) e pode contribuir para consequências cardiovasculares adversas (MARTINS et al., 2012).

Trabalhadores diurnos são indivíduos que trabalham em horário comercial e, teoricamente, são “menos” dessincronizados quando comparados às pessoas submetidas à escala de turnos (LAJOIE et al., 2015; RAMIN et al., 2015). A população de trabalhadores em turnos frequentemente apresenta alterações no ciclo sono/vigília e no comportamento alimentar (BUXTON et al., 2012; CHAPUT et al., 2007; SPIEGEL et al., 2004), que podem culminar na dessincronização entre os sinais ambientais e o ritmo circadiano endógeno. Sabe- se que os processos biológicos mantêm um ritmo diário que é mediado por um sincronismo entre sinais ambientais e o relógio circadiano interno, que contribui para manutenção da homeostase metabólica (BASS; TAKAHASHI, 2010; KUMAR JHA; CHALLET; KALSBEEK, 2015). Portanto, podemos inferir que o diferente perfil de secreção de OB-Re verificado nos grupos de trabalhadores em turnos (GM e GN) pode ser reflexo desse estilo de vida dessincronizado. Em situações em que o comportamento e o sistema circadiano ficam desalinhados, mudanças na biodisponibilidade da leptina podem ocorrer, criando um ambiente favorável para o desenvolvimento de distúrbios metabólicos (SHEA et al., 2005).

Até o ano de 2002 pouco se sabia sobre o perfil diário de secreção de OB-Re, uma vez que os estudos não avaliavam diretamente esse receptor. Foi nesse ano que Chan et al. (2002) avaliaram as concentrações de OB-Re a cada 15 minutos, durante 24 horas, em seis jovens magros (idade média 20,3 ± 0,6 anos e IMC 22,8 ± 0,9 kg/m²) do sexo masculino, saudáveis, sem transtornos no ciclo sono-vigília e verificaram um ritmo circadiano para OB-Re, indicando que existia uma variação diurna nos níveis de OB-Re. Em concordância com os resultados de Chan et al. (2002), os resultados de Wardlaw et al. (2014) também verificaram uma variação nos níveis de OB-Re ao longo de 24 horas (p=0,003) ao analisar um grupo de oito indivíduos saudáveis (5 homens e 3 mulheres), com idade média de 34,5 anos e IMC médio de 27,8 Kg/m². Os nossos resultados diferem desses dos dois estudos citados, uma vez que não observamos um efeito do fator tempo sobre os níveis de OB-Re em trabalhadores em turnos e diurnos.

Em oposição aos resultados de Chan et al. (2002) e Wardlaw et al. (2014) e de acordo com nossos achados, Shea et al. (2005) não verificaram um ritmo circadiano significativo sobre as concentrações de OB-Re. O objetivo do estudo de Shea et al. (2005) foi avaliar a contribuição dos fatores circadianos endógenos e dos fatores comportamentais nas concentrações circulantes de adipocinas em seis indivíduos do sexo masculino, saudáveis

(idade média: 30,7 anos; IMC médio: 25,2 kg/m²) que foram mantidos em laboratório e submetidos a um protocolo de dessincronização/ressincronização circadiana. Diante das divergências encontradas na literatura acerca do padrão diário de secreção de OB-Re e dos seus possíveis fatores influenciadores é fundamental a realização de mais estudos com essa temática.

Sabe que as alterações no horário de sono/vigília podem levar a um aumento no FLI, forma fisiologicamente ativa da leptina, o que pode influenciar a ingestão alimentar e balanço energético ocasionando aumento da obesidade e doenças cardiovasculares na população de trabalhadores em turnos. Mudanças no ritmo sono-vigília que ocorrem em trabalhadores em turnos poderiam induzir um maior nível de leptina livre, influenciando a ingestão alimentar e o balanço energético (SHEA et al., 2005). No entanto, no presente estudo não foram encontrados efeitos do tempo, do turno e interação tempo x turno sobre as medidas do FLI entre os grupos estudados. A ausência de resultados significantes na análise do FLI nos três grupos do presente estudo pode ter ocorrido devido ao baixo tamanho amostral e porque analisamos apenas indivíduos saudáveis e não obesos.

Indivíduos obesos apresentam elevados valores de FLI, resultantes da alta liberação de leptina pelos adipócitos, uma vez que os níveis de leptina total são proporcionais à massa gorda e também devido à resistência à leptina (MYERS et al., 2010). Além do aumento de leptina total, em obesos acontece também redução nos níveis de OB-Re como parte de um mecanismo que visa reduzir o aumento da leptina total (VAN DIELEN et al., 2002), na tentativa de normalizar a homeostase energética. Van Dielen et al. (2002) analisaram a razão molar de leptina e OB-Re no plasma de indivíduos magros e obesos. Os autores verificaram que a proporção molar de leptina livre e Ob-Re foi de 1:1 em pessoas magras. Por outro lado, nos indivíduos com obesidade mórbida foi verificado uma proporção de 25:1, confirmando assim o elevado FLI em indivíduos obesos.

No presente estudo verificamos um diferente padrão de secreção de OB-Re nos trabalhadores em turnos, porém isso não se refletiu, como seria esperado, em um diferente perfil de FLI nesses trabalhadores, já que o OB-Re é um dos determinantes do FLI. Porém, a possível influência do turno de trabalho sobre a secreção de OB-Re pode ser um sinal de que alterações no sistema leptina já poderiam ter sido iniciadas nesses trabalhadores, o que poderia predispor esses indivíduos a alterações metabólicas. De qualquer maneira, essa possibilidade deve ser confirmada por estudos futuros.

O nosso estudo avaliou, pela primeira vez, as variações nas concentrações médias de OB-Re e FLI em trabalhadores em turnos e diurnos. Os resultados obtidos apresentam

evidências consistentes de que existem diferenças determinadas pelo turno de trabalho sobre os perfis diários de OB-Re, a isoforma do receptor de leptina capaz de regular a biodisponibilidade desse importante hormônio que regula a ingestão alimentar, entre indivíduos que trabalham em turnos e diurnos.

Portanto, os resultados do presente estudo sugerem que a ação da leptina pode ser influenciada pelo turno de trabalho. Estudos adicionais são necessários para elucidar se estes resultados podem contribuir para a elevada prevalência de distúrbios metabólicos comumente verificados nesses trabalhadores (AXELSSON; PUTTONEN, 2012; GUO et al., 2015; PEPLONSKA; BUKOWSKA; SOBALA, 2015).

9. CONCLUSÕES

Os resultados desse estudo nos permite concluir que:

 A concentração média em 24 horas de OB-Re e FLI foi semelhante entre os três turnos de trabalho.

 Foi encontrado um efeito do turno sobre as concentrações de OB-Re ao longo das 24h, com maiores valores no grupo GD em relação ao GM e GN.

 Não foram encontrados efeitos do tempo ou da interação tempo x turno sobre as concentrações de OB-Re.

 Não foram encontrados efeitos do tempo, turno ou interação tempo x turno nas medidas do FLI.

Esses resultados são fundamentais para compreender melhor a ação da leptina em trabalhadores em turnos. O diferente perfil de secreção de OB-Re verificado nos grupos de trabalhadores em turnos (GM e GN) pode ser reflexo do estilo de vida dessincronizado. Neste cenário, nós sugerimos que mudanças na biodisponibilidade da leptina podem ocorrer interferindo na homeostase metabólica. Portanto, é importante se atentar ao sistema leptina em trabalhadores em turnos.

É importante se concentrar em melhorar a duração do sono e estratégias de realinhamento do ritmo circadiano com a intenção de minimizar a dessincronização dos osciladores circadianos a nível central e periférico. Além disso, encontrar melhores práticas alimentares, de estilo de vida e rotina para atenuar as respostas fisiológicas indesejáveis.

Pesquisas futuras poderiam ser direcionadas também no sentido de encontrar um modelo mais eficiente de trabalho em turnos que minimizasse seus efeitos na saúde dos trabalhadores.

Mais estudos, empregando amostras maiores, indivíduos com uma faixa etária mais ampla e de ambos os sexos, e separar efeitos devido à alterações nos padrões de sono e ingestão alimentar, são necessários.

10. LIMITAÇÕES DO ESTUDO

Este estudo apresentou algumas limitações:

 Foram incluídos apenas homens, jovens e saudáveis por um período único de 24 horas.

 Trata-se de um estudo transversal, que não permite estabelecer relação de causa/efeito entre trabalho em turno e alteração no perfil diário de Ob-Re.

 As coletas de sangue para dosagens de leptina e OB-Re foram realizadas de 6/6 horas durante 24 horas. Intervalos menores entre as coletas permitiria conhecer melhor os períodos de pico e nadir de OB-Re ao longo de 24 horas.

REFERÊNCIAS

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ANDRADE, M. M. M. Ciclo vigília-sono de adolescentes: um estudo longitudinal. 1991. 119 f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 1991.

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