fonksiyonel grubu; (B) taşıyıcıların bağlama özelliği; (C) taşıyıcı; (D) boşluk
Şema 1.5.’de kovalent bağlanmış bir immobilize enzim, enzim, bağlantı, çapraz bağlama ajanı ve taşıyıcıların bileşenlerininin bir çok parçadan oluşmuş şekil verilmiştir (Cao 2006). Böylece kovalent bağla bağlanmış bir immobilize enzimin performansını etkileyen faktörler sırasıyla :
Taşıyıcının fiziksel özelliği (gözenek büyüklüğü, partikül büyüklüğü, gözenekliliği, şekli)
Taşıyıcının kimyasal tipi (yapının kimyasal kompozisyonu, aktif işlevselliği, diğer aktif olmayan işlevsellikler)
Zincirin kimyasal yapısı veya bağlanma özelliği
İmmobilize olduktan sonra veya immobilize edilirken enzimin konformasyonu
Çapraz bağlama ajanın uzunluğu ve özelliği
Enzimleri bağlamak için kullanılan ortamın özellikleri Taşıyıcı ve enzim arasında oluşan bağların sayısı Taşıyıcıların içinde veya üzerindeki enzim dağılımı Kovalent bağlanma yöntemlerinin avantaj ve dezavantajları:
AVANTAJLARI
Biyokatalizör ve taşıyıcı arasındaki güçlü etkileşimden dolayı biyokatalizör kararlılığı genellikle artar.
Reaktif taşıyıcıya enzim bağlanması kolaydır ve bağlı olmayan enzim yıkama ile uzaklaştırılabilir.
Enzim ve taşıyıcı arasında bağlar kuvvetli olduğundan enzim çözeltiye sızmaz veya ayrılmaz.
Reaksiyon ortamından istenilen anda uzaklaştırılabilir.
Taşıyıcını yapısına bağımlı olarak yeni spesifikler kazanabilir. Sürekli sistemlere uygundur.
Değişik fiziksel formlarda (tabaka, partikül, fiber vb.) imal edilebilirler.
DEZAVANTAJLARI
Bağlanma aktivite için zorunlu aminoasit fonksiyonel grupları üzerinden gerçekleştiği için aktivite düşebilir.
Enzimin taşıyıcıya bağlanması özel ve masraflı hazırlıklar gerekli kılabilir. Biyokatalizörün toksik ajanlara ve sert reaksiyon koşullarına maruz
kalmasından dolayı ürün verimindeki düşüş gözlenir.
Taşıyıcının yenilenmesi ve biyokatalizörün taşıyıcıdan geri kazanılmasının imkansız olması.
Kovalent bağların oluşumuna dayanan metotlarla proteinlerin immobilizasyonu yaygın olarak kullanılır. Bu metodun avantajı enzim ile matriks arasında oluşan bağların dayanıklı olmasından enzim çözelti ortamına salınmaz. Buna karşın bağlanan aktivitenin çok yüksek olması için temel amino asit fonksiyonel grupları katalitik aktivite için destek maddesine kovalent bağlanma gerektirmemelidir. Bu bazı durumlarda zorluk yaratabilir.
Reaksiyon genellikle sulu ortamda gerçekleşir. Bu yöntemde kullanılan taşıyıcılar reaktif değillerse yardımcı bir reaktif ile aktive edilmeleri gerekir. Yöntemin gerçekleştirilmesi zordur. Enzim ile taşıyıcı arasındaki bağlanma yüksek olduğundan bazen enzimatik aktivitenin arttığı da görülmektedir. (Mattiasson ve Kaul 1991). Fonksiyonel gruplar içeren taşıyıcıya bağlı çok çeşitli reaksiyonlar geliştirilmiştir (Scouten 1987). Bağlama metotları genelde iki kısma ayrılır : (1) bir polimere bir reaktif fonksiyonel ekleyerek taşıyıcının aktivasyonu (2) aktivite edilmiş bir grup üretmek için polimerin ana yapısının modifikasyonu (Çizelge 1.9). Bu aktivasyon prosesleri genellikle, bağlama kısmında proteinlerdeki güçlü nükleofillerle reaksiyona girerek destek maddesindeki elektrofilik grupları üretmek için tasarlanılırlar. Taşıcıya kovalent bağlama yolunun temel prensipleri proteinlerin kimyasal modifikasyonu için kullanılmasıyla benzerdir. Reaksiyonlarda, aminoasitlerin yan zincirlerinde lisin (ε-amino grup), sistein (tiyol grup), aspartik asit ve glutamik asit (karboksilli asit) bulunanlar çok sık kullanılırlar.
Çizelge 1.9.A Enzimlerin Kovalent Bağlama Metotları: Hidroksil fonksiyonlu
matriksin aktivasyonu
Aktivasyon metodu Reaktantların grubu (aktivite edilmiş matriks ile)
Referans
Tresil klorür (2,2,2- trifluoroethanesulfonil klorür), sülfonil klorür
Tiyol, aminler Lawson ve ark. (1983)
Siyonejen bromür Amin Axén ve ark. (1967)
Epoksitler Tiyol, amin Porath ve Axén, (1976)
Epiklorhidrin Tiyol, amin Porath ve Axén, (1976)
Glutaraldehit Amin Porath ve Axén, (1976)
Glisidol-glioksil Amin Guisán (1988)
N-hidroksi süksinimidil Amin Wilchek ve Miron, (1982); Drobníck ve ark. (1982)
Çizelge 1.9.B Aktivite edilmiş bir grup oluşturmak için polimerin modifikasyonu Polimer Reaktantların grubu Reaktif Üretilen aktive edilmiş grup Reaktantların grubu (aktive edilmiş matriks ile) Referans Selüloz agoroz
Diol Periodat Aldehit Amin Parikh ve
ark. (1974)
Poliakrilamit Amit Hidrazin Hidrazit Amin Inman ve
Dintzis (1969)
Poliakrilamit Amit Asit pH Karbosilik
asit Amin Inman ve
Dintzis (1969) Polyester Ester Asit pH Karbosilik
asit + alkol Amin Rozprimova ve ark. (1978) Polietilen CH2 Nitrik asit Karboksilik asit
Amin Ngo ve ark.
(1979) Polistiren Nitrik asit Nitratlı aromatik halka Histidin, Tirozin Grubhofer ve Schleith (1954); Beitz ve ark. (1980)
Naylon Amit Hidrazin Hidrazit Amin Hornby ve
Goldstein (1976)
1.4.2.1.3. İyonik bağlama ile immobilizasyon
İyonik bağlama metodu iyon-değiştirme kalıntıları içeren suda çözünmeyen taşıyıcılar için enzim proteinin iyonik bağlanmasına bağlıdır. İyon değiştirme merkezine sahip olan polisakkaritler ve sentetik polimerler genellikle taşıyıcılar için kullanılır. İyonik bağlanma kovalent bağlamadan daha ılıman koşullarda gerçekleşir,
bundan dolayı iyonik bağlanma sırasında konformasyonal değişikliklerin derecesi kovalent bağlamadan daha azdır. Aktif merkezde değişikliğe uğramaz. Enzim aktivitesi kovalent bağlama ve fiziksel adsorpsiyona kıyasla daha yüksek olduğu için, iyonik bağlama bir enzimi immobilize etmek için çok daha uygun bir metottur (Cao ve ark, 2003). Ancak enzim ile taşıyıcı arsındaki bağ, kovalent bağ kadar güçlü değildir. Bu nedenle enzim kaçışı söz konusudur.
1.4.2.1.4. Şelatlama veya Metal bağlama
Organik taşıyıcıların yüzeyde depolanmış hidroksitler veya metal tuz geçişleri matrikste nükleofilik gruplarla koordinasyonu ile bağ yapar. Başlıca titanyum ve çinko tuzları kullanılır ve bu metod “metal bağ immobilizasyonu” olarak bilinir (Cabral ve Kennedy,1991; Cabral ve ark., 1986; Kennedy ve Cabral, 1985). Metal tuz veya hidroksit nötürleştirme veya ısıtma ile destek maddeleride (selüloz, kitin, aljinik asit ve silika bazlı taşıyıcılar gibi) çöktürülür. Sterik faktörler yüzünden, metalin tüm koordinasyon pozisyonlarını işgal etmek matriks için mümkün değildir. Bundan dolayı bazı pozisyonlar enzimlerden gruplar ile koordine için serbest kalır. Bu metod oldukça kolay ve bu yolla enzimlerle elde edilen immobilize spesifik aktiviteleri oldukça yüksek (%30-80) olur. Bununla birlikte elde edilen kullanıma hazır stabiliteler oldukça değişken ve bu sonuçlar kolaylıkla tekrar üretilemez. Tekrar üretilememesinin nedeni muhtemelen düzenli olmayan adsorpsiyon olmasından ve destek maddesinden önemli metal iyon sızıntısı olmasından kaynaklanır. Adsorpsiyon bölgelerinin oluşumunun kontrolünü artırmak için, şelatlayıcı ligantlar dayanıklı kovalent bağlar vasıtasıyla katı destek maddelerinde immobilize edilebilirler. Metal iyonlar ardından koordinasyon ile bağlanır ve oluşan dayanıklı kompleksler proteinlerin tutma için kullanılabilir. Bağlanan proteinlerin elüsyonu pH’ın azaltılmasıyla veya çözünür ligantların rekabetiyle kolaylıkla elde edilebilir. Destek maddesi daha sonra etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) gibi güçlü bir şelatlayıcı ile yıkanarak rejenere edilir. Metal şelatlanmış destek maddeleri immobilize metal-iyon affiniti (IMA) olarak isimlendirilir ve protein kromatografisinde yaygın olarak kullanılır (Porath 1992, Kågedal 1998). Enzim
immobilizasyonu için destek maddesi olarak farklı IMA-jelleri kullanılmasıyla bir model olarak Eschericia coli -galaktosidaz kullanılarak çalışılmıştır (Brena ve ark. 1994).
1.4.2.2. Çapraz bağlama ile immobilizasyon
Kovalent bağlama metodundaki gibi kimyasal bağların oluşumuna dayanan ve bifonksiyonel veya multifonksiyonel reaktif ile enzimlerin moleküller arası çapraz bağlama olarak tanımlanabilir fakat suda çözünmeyen taşıyıcılar kullanılmaz (Sheldon 2007) (Şema 1.6). Bu immobilizasyon iki veya multifonksiyonel reaktiflerle enzim molekülleri arasında moleküller arası çapraz bağların oluşumuyla gerçekleştirilir. En yaygın reaktif glutaraldehittir. Ayrıca hekzametilendiizosiyanat, heterosiklik halojenürler, divinilsülfonlar, epiklorhidrin, diazobenzidin gibi maddeler kullanılır. Çapraz bağlama reaksiyonları oldukça sert şartlarda gerçekleştirilir. Bu sert şartlar enzimin aktif bölgesinin oluşumunu değiştirebilir ve böylece büyük aktivite kaybına sebep olabilir.
Bu metod üç farklı durumda uygulanabilir:
Yakın ultraviyole radyasyona maruz kalmasıyla jelleşme ve bir enzim çözeltisi ile karıştırarak erime, bir fotosentez yapıcı (benzoin etil eter gibi) ile ön polimerlerin karışımı
Küçük boncukların oluşumunda enzim içeren bir monomer çözeltisini karıştırmak. Polimerizasyon ondan sonra gamma radyasyonu kullanarak başlatılır.
Bir çapraz bağlayıcı ajan ve akrilamit monomerinin tamponlu sulu çözeltide enzim karıştırılır. Polimerizasyon bazı kimyasallar eklenerek başlatılılabilir.