Diğer taraftan, spesifik olmayan bir taşıyıcının türevlendirilmesi spesifik bir adsorbentin oluşumuna yol açar. Örneğin, silikajel enzim immobilizasyonu için (başlıca hidrofilik etkileşim ile) spesifik olmayan adsorbent olarak kullanılabilir buna karşın uzun alkil zincire sahip silikajel hidrofobik etkileşimlerle enzim adsorpsiyonu için spesifik adsorbent olarak kullanılabilir. Bu şartlar altında yapısının hidrofilik özelliği korumuşlar (Nemat-Gorgani ve Karimian, 1986). Spesifik bağ gruplarının tanıtımı adsorpsiyon kapasitesini genellikle artırır. Örneğin, poli (HMA-co-MMA) mikroküreler üzerinde enzimlerin spesifik adsorpsiyon kapasitesi taşıyıcı için
affinite boyalar bağlanmasıyla yolun boyu artırılmış (Denizli ve ark., 2000). Spesifik olmayan fiziksel ve spesifik etkileşim arasındaki diğer yöntemlerin farklılıkları spesifik olmayan etkileşimde olan güçlerin spesifik adsorpsiyon ile karşılaştırıldığında genellikle çok zayıf etkileşim olmasıdır.
Bu alandaki araştırmalar enzim taşıyıcı olarak yeni gözenekli materyaller araştırılmıştır. İnorganik materyaller, örneğin; zeolitler (Knezevic ve ark., 1998; Liu ve ark., 1997), cam boncuklar (Scharer ve ark., 1992; Bosley ve Claytom 1993), selit (Kermasha ve Bisakowski 1998, Castro ve ark., 1999; Fadıloglu ve Soylemez 1998), silikajeller (Sonnet ve ark., 1994; Maeda ve ark., 1997) ve CaCO3 (Rosu ve ark.,
1998) ve organik polimerler : polipropilen (Pencreac’h ve Baratti 1997), polietilen (Huang ve Ju 1994), polistiren divinilbenzen ve türevleri (Xu ve ark., 1995) ve polivinil alkol (Carbone ve ark., 1999) enzim taşıyıcı olarak kullanılmıştır. Tipik bir prosedür olarak, öncelikle enzim bir çözücüde çözünür ardından gözenekli destek maddesi ile bir süre boyunca ıslatılır. Bu immobilizasyon ıslatılmış gözenekli destek maddesinin kurutulması ve yıkanmasıyla tamamlanır. Enzimler ve gözenekli destek maddesi arasında birliği artırmak için daha sonra arasıra fonksiyonel grupların eklenmesiyle termal kararlılık aktarılır. Enzim ve destek maddesi arasında zayıf etkileşimden dolayı bu immobilize olmuş enzim normalde uzun süre dayanıksızdır.
Adsorpsiyon immobilizasyonuna bir örnek olarak Knezevic ve ark. (1998) verilebilir. Enzim taşıyıcı olarak Zeolit Y kullanmışlardır. Candida rugosa lipaz immobilize edilmiş ve bu immobilize enzim hurma yağının hidrolizinde kullanılmıştır.
1.4.2.1.2. Kovalent bağlama
Uygun bir destek maddesi ile enzimleri kovalent bağlama metoduyla enzim immobilizasyon için ikinci metot olarak geliştirilmiştir. Enzimlerin kovalent immobilizasyonu 1950’lerden beri gelişmektedir ve günümüzde enzim immobilizasyonu için önemli bir metot olmuştur. Çünkü kovalent bağlar diğer kovalent olmayan adsorpsiyon bazlı enzim immobilizasyon metotları ile
karşılaştıracak olursa genellikle enzim ve taşıyıcı arasında en güçlü bağları sağlar (Zarbosky 1973). Bundan dolayı kullanılan matriksten enzimin sızıntısı kovalent bağlanmış immobilize enzimler ile sıklıkla minimuma indirilmiş olunur.
Bu metot enzim immobilizasyonu için birçok kimyasal reaksiyonları içerir. Genelde gözenekli taşıyıcı immobilizasyon basamağından önce aktivite edilmelidir. Ardından çapraz bağlayıcı bir ajan, enzimin fonksiyonel bir grubuyla aktivite edilmiş taşıyıcıyı bağlamak için kullanılır. Bu araştırma alanında gözenekli taşıyıcılar ve enzimler için çapraz bağlayıcı ajanlar ve uygun aktivasyon araştırılarak birçok çalışmalar yapılmıştır (Bhatia ve ark., 1998)
Çok basamaklı enzim immobilizasyon tekniği süresince enzimin deaktivasyonuyla sonuçlanır. Buna rağmen eğer gerekli kimyasallar enzimle uyumlu olurlarsa enzim ile destek maddesi arasında kovalent bağdan dolayı immobilize enzim iyi aktivite gösterebilir (Gao 2004).
Fonksiyonel grup ve desteğin seçimi enzim ve desteğin davranışı ve enzimin dayanıklılığına bağlıdır. Desteğin fonksiyonel gruplara kovalent bağlanması katalitik hareket için enzimin yapısında gerekli olmayan bölgeden yapılır. Burada enzim dayanıklılığını artırmak için kullanılan bir kaç koruyucu metotlar vardır (Cao ve ark., 2003).
İnhibitör veya substratın varlığında enzimin bağlanması Tersinir enzim-inhibitör kompleksi
Çapraz bağlayıcı ile kimyasal olarak modifiye edilmiş enzim
Kovalent immobilizasyona bir örnek olarak Cho ve Rhee (1993) tarafından gerçekleştirilen silika bazlı immobilizasyonu verebiliriz (Şekil 1.9). Bu immobilizasyon şeması Şekil 1.9’da verilmiştir. Mucor miehei lipaz kovalent olarak beş aminoalkil asit çapraz bağlayıcılarla (3-aminopropiyonik asit, 5-aminovalerik asit, 6-aminohekzanoik asit, 7-aminoheptanoik asit ve 8-aminooktanoik asit) ve florisil aktivasyon aracı olarak glutaraldehitinde yardımıyla florisil üzerine (bir inorganik matriks: magnezyum silikat) immobilize etmişlerdir. Bu immobilize lipazı zeytin yağın hidrolizinde kullanmışlardır (Gao 2004).
Si OH Silenizasyon Si (CH2)3NH2 Glutaraldehit Si (CH2)3N CH(CH2)3CHO Aminoalkil asit Si (CH2)3N CH(CH2)3CHN(CH2)nC O OH Karbodiimid Si (CH2)3N CH(CH2)3CHN(CH2)nC O O C+ NH NH R' R'' +NH2-Lipaz Si (CH2)3N CH(CH2)3CHN(CH2)nC O NH-Lipaz
Şekil 1.9. Silika-bazlı bir materyale enzimin kovalent bağlaması
Knezevic ve ark. (2006), Eupergit C destek maddelerine Candida rugosa lipazın immobilizasyon için üç farklı kovalent immobilizasyon metodu uygulaşmışlardır. Enzim yüklemeleri, aktiviteleri ve bağlama verimleri karşılaştırmışlardır. Geliştirilmiş bu immobilizasyon prosedürü sulu sistemde oldukça kolay ve kolaylıkla tekrar kullanılabilir ve lipaz uygulamaları için umut verici bir çözüm sağladığını savunmuşlardır (Şekil 1.10).
O O NH2-Lipaz O N H OH Lipaz a) Metod I Eupergit Eupergit NH2 Glutaraldehit Eupergit N CH(CH 2)3 C O H Eupergit N CH(CH 2)3 C H N Lipaz Lipaz b) Metod II O OH H OH OR Lipaz O NaIO4 O OR CHO Lipaz O OHC H Eupergit NH 2 Lipaz CO H Eupergit N C Lipaz H c) Metod III
Şekil 1.10. Eupergit üzerinde lipaz immobilizasyonunun üç farklı kovalent
metodunun şematik gösterimi
Genelde bir taşıyıcıya enzimin kovalent bağlanması enzim yüzeyine yerleşmiş amino asitlerin –NH2, -SH, -COOH gibi fonksiyonellerinden bağlanır.
reaksiyona dayanır. Şema 1.5’de gösterilmiştir. Etkili bağlantıyı elde etmek için enzim ve taşıyıcının işlevselliği immobilizasyondan önce aktive edilmelidir. Sık sık taşıyıcılar enzim bağlamak için kullanılmadan önce aktivite edilir. Bağların sayısı veya bağlanma modelinin kontrolü olan bir çok durumda gereklidir (Gemeiner 1992), Enzimler taşıyıcıya bağlamadan önce aktivite edilmelidir (Glazer ve ark. 1962).
TASIYICI E Aktif aminoasit fonksiyonel grubu Tasiyidaki baglanan gruplar Bosluk A B C D