Türkiye’de İşletme Gruplarının Tarihsel Süreç İçerisinde Gelişimi

histoquímica

dos

tumores

diagnosticados na histologia como

mastocitoma

Os dados clínicos referentes à idade, a raça e ao sexo além das informações a respeito do grau histológico e dos resultados da imuno- histoquímica de todos os animais com diagnóstico histológico de mastocitoma podem ser vistos no apêndice 1.

Dos 142 (40,46%) casos com diagnóstico histológico de mastocitoma, 96 (67,61%) foram confirmados pela imuno-histoquímica e, o restante (46/32,39%) negativos para o CD117 (c-KIT). A maioria dos casos negativos foi histologicamente definida como mastocitomas pobremente diferenciados ou mastocitomas grau III (Tabela 6). Dessa forma, foi realizada imuno-histoquímica para os marcadores CD45, CD3 e CD79a, na tentativa de se conhecer a origem desses tumores. Nos casos 7M, 11M, 15M, 20M, 41M, 44M e 85M também foi utilizada a (pan) citoqueratina AE1/AE3 para descartar uma possível origem epitelial, por exemplo, células basais. O diagnóstico final desses tumores foi de linfoma T, plasmocitoma, tumor venéreo transmissível, sarcoma histiocítico localizado e histiocitoma cutâneo. Dezessete casos não se tratavam de

proliferação neoplásica e sim de um processo inflamatório crônico, composto delinfócitos, histiócitos e polimorfonucleares (Tabela 7).

Na maioria dos casos em que não foi confirmado mastocitoma pela imuno- histoquímica observou-se a presença de mastócitos residentes CD117+ infiltrados no tumor (Figura 1).

Em todos os casos de linfoma T, sinal positivo do marcador CD3 foi marcante o que definiu o diagnóstico (Figura 2). Os animais 111M e 134M também apresentaram sinal positivo multifocal do marcador CD79a, interpretada como componente inflamatório do tumor. Somente nos cães 42M, 43M, 111M, 134M foi observado sinal positivo do marcador CD45. Os cães 39M, 42M, 52M e 134M tiveram seus diagnósticos definidos como linfoma T epiteliotrópico, devido à infiltração das células tumorais na epiderme.

Nesses casos podem-se observar células tumorais dispostas difusamente na epiderme ou em pequenos grupos (“clusters”) e/ou no epitélio de folículos pilosos, glândulas apócrinas e glândulas sebáceas (Figura 3 e 4). Linfoma T não-epiteliotrópico CD3+ ocorreu nos animais 3M, 13M, 19M, 22M, 26M, 30M, 33M e 111M (Figura 5). Na Diagnóstico final CD117 CD3 CD79a CD45 Citoqueratina

AE1/AE3 E-caderina Vimentina

Mastocitoma + - - - NR NR NR Histiocitoma - - - ± - ± NR Plasmocitoma - - ± - NR NR NR Linfoma T - + - ± NR NR NR Linfoma B - - + - NR NR NR TVT - - - ± - NR + Sarcoma histiocítico localizado - - - ± NR -* NR

maioria desses casos as células neoplásicas se localizavam próximas à epiderme, na derme superficial, mas sem haver contato íntimo entre elas ou na derme profunda. O cão 13M apresentou um tumor profundo infiltrado no subcutâneo e na musculatura. A epiderme ulcerada do animal 43M impossibilitou a classificação do linfoma T em epiteliotrópico ou não-epiteliotrópico.

Tabela 6 - Número de casos e seus respectivos graus histológicos dos mastocitomas negativos para o CD117.

Diagnóstico histológico Número Casos

Mastocitomas grau III 31

Mastocitoma grau II 5 Mastocitoma grau I 3 Mastocitoma 1 Mastocitoma grau II a III 6 Total 46

Tabela 7 - Casos diagnosticados histologicamente como mastocitomas, negativos para o CD117 e seus respectivos diagnósticos finais.

Diagnóstico Final Cães

Linfoma T 3M 13M 19M 22M 26M 30M 33M 39M 42M 43M 52M 111M 134M Plasmocitoma 14M 40M 65M 69M TVT 16M 51M 90M Sarcoma histiocítico localizado 37M 38M Histiocitoma 7M 11M 15M 20M 41M 44M 85M Dermatite* 8M 12M 18M 24M 25M 28M 35M 36M 45M 54M 75M 81M 82M 95M 103M 133M 136M

*não está considerado o caso 58M

Na maioria dos casos diagnosticados histologicamente como mastocitomas e definidos como plasmocitomas, as células foram positivas para CD79a. No cão 40M e 65M foi observada marcação citoplasmática positiva intensa, enquanto que no cão 69M a marcação foi multifocal. Não foi observado sinal positivo desse marcador no animal 14M, porém o diagnóstico de plasmocitoma foi possível pela associação entre os resultados da imuno-histoquímica (negatividade para todos os outros marcadores) e pela morfologia das células, que apresentavam núcleo periférico, típicos de plasmócitos. No cão 14M marcação para CD3 foi observada de forma multifocal, em um padrão típico de células inflamatórias. Em todos os casos não houve marcação para

CD45 e o resultado da imuno-histoquímica para citoqueratina AE1/AE3 feita no caso 14M foi negativo.

As neoplasias dos cães 16M, 51M e 90M diagnosticadas previamente como mastocitoma grau III foram reclassificadas como tumor venéreo transmissível. Todos os casos foram negativos para o CD117, CD3 e CD79a e somente no caso 90M foi observado sinal positivo intenso e multifocal para CD45. O caso 16M também não mostrou sinal positivo para citoqueratina AE1/AE3. Esse foi o único tumor que apresentava células próximas a epiderme e por isso foi feita citoqueratina. Todos esses casos foram positivos para vimentina (Figura 6). Nos casos 51M e 90M, as células

tumorais estavam localizadas profundamente, ou seja, distantes da epiderme, auxiliando na interpretação da marcação pelo anticorpo CD45.

Os tumores dos cães 37M e 38M com sarcoma histiocítico localizado foram previamente diagnosticados na histologia como mastocitoma grau III. Estes tumores foram negativos para CD117, CD3 e CD79a. O cão 37M teve sinal positivo intenso para CD45 e foram observadas características de malignidade como megalocitose e células multinucleadas. Esses resultados auxiliaram no diagnóstico de sarcoma histiocítico e não de histiocitoma cutâneo. O cão 38M não mostrou sinal positivo para CD45 e pelo fato de apresentar células em cordão, partindo da epiderme, as possibilidades de histiocitoma cutâneo, sarcoma histiocítico localizado, tumor de células basais, carcinoma de células basais e melanoma foram questionadas. A negatividade para citoqueratina AE1/AE3 afastou a origem epitelial. Nenhum marcador de melanócitos foi utilizado nesse estudo e células com pigmento preto (melanina) no citoplasma não foram observadas. Esse tumor, assim como o caso 37M também apresentava características malignas e, por isso foi definido como um sarcoma histiocítico localizado e não como histiocitoma, apesar da falta de marcação pelo CD45.

Os cães 7M, 11M, 15M, 20M, 41M, 44M, 85M não mostraram sinal positivo para nenhum dos marcadores utilizados. Na histologia, a maioria deles foi diagnosticada como mastocitoma grau III e no animal 7M o grau histológico não foi definido com exatidão (mastocitoma grau II a III). Todos esses casos tinham um padrão morfológico em comum com células em cordão, partindo da epiderme (Figura 7). Assim como no cão 38M, as células que poderiam sofrer transformação neoplásica nesse local seriam as células de Langerhans, as células da camada basal da epiderme ou os melanócitos. A negatividade para

citoqueratina AE1/AE3 afastou a possibilidade de o tumor ser de origem epitelial. Em todos os casos, exceto o cão 15M mostraram reatividade para E-caderina nas células tumorais próximas à epiderme (Figura 8). Apesar da falta de sinal positivo para o marcador CD45, esses tumores foram definidos como histiocitomas cutâneos devido à reatividade para E-caderina e a negatividade para os demais marcadores que afastaram as possibilidades de mastocitoma, linfoma T, linfoma B e plasmocitoma. Apesar da falta de reatividade para E- caderina, o diagnóstico de histiocitoma também foi feito no cão 15M devido a negatividade para CD3, CD79a, CD117 e citoqueratina AE1/AE3 em associação com a morfologia do tumor (células em cordão, localizadas perpendicularmente a epiderme e células com núcleos com invaginação lateral, citoplasma abundante).

Resultado interessante ocorreu com o cão 58M. Ele foi diagnosticado previamente com mastocitoma grau I, no lábio (cabeça) e mastocitoma grau III no dorso. Dessa forma, ele tinha sido classificado como tendo um mastocitoma grau III multicêntrico. Na imuno-histoquímica ele apresentou o padrão KIT I, no lábio e, no dorso, não observou-se proliferação neoplásica e sim um processo inflamatório, classificado como dermatite histiocitária e linfocitária.

Dezenove cães (13,38%) dos 142 casos de mastocitomas foram definidos histologicamente como mastocitomas com metástase para linfonodos regionais. Imuno- histoquímica do tumor primário e das metástases foi realizada. Um desses cães (136M) apresentou dermatite com mastocitose linfática e não um mastocitoma metastático. Ele tinha sido diagnosticado com mastocitoma grau II com metástase

para linfonodos inguinais. O “tumor primário” que não teve sua localização

informada era composto de poucas células e uma população mista de histiócitos, polimorfonucleares, fibroblastos e

mastócitos. A imuno-histoquímica do linfonodo revelou a presença de pequena quantidade de mastócitos não-neoplásicos no seio linfático. Os dados referentes ao grau histológico e a marcação pelo CD117 nos tumores primários e nas metástases podem ser vistos na tabela 8. Dos 18 cães com metástase de mastocitoma confirmadas pela imuno-histoquímica, 6 (33,33%) tiveram aumento da marcação citoplasmática, ou seja, marcação aberrante do CD117 nas metástases. Porém, não foram observadas diferenças estatísticas entre o padrão KIT no tumor primário e nas metástases (p>0,05), sendo que correlação positiva de 78% foi encontrada (p<0,05) (Gráfico 1). Para análise estatística não foram considerados os casos 17M e 57M, pois a avaliação do padrão KIT não foi feito no tumor primário e na metástase.

Dos 96 casos de mastocitomas confirmados pela imuno-histoquímica, 78 (81,25%) consistiam de mastocitomas sem metástase.

Cerca de 70,59% dos mastocitomas grau I mostraram marcação peri-membrana (KIT I) (Figura 9) e, o restante, apresentou o padrão KIT II (Figura 10), ou seja, marcação citoplasmática focal. Os mastocitomas grau II tiveram o padrão KIT I em 59,26% dos casos e em 25,93% foram observados marcação citoplasmática focal (padrão KIT II). 14,81% dos mastocitomas grau II foram classificados com o padrão KIT III (Figura 11). Cerca de 47,06% dos mastocitomas pobremente diferenciados (grau III) foram classificados com o padrão KIT III, 41,18% com o padrão KIT II e 11,76% com o padrão KIT I. Os dados referentes ao grau histológico e ao padrão de marcação do CD117 nesses tumores estão incluídos na tabela 9. Através do teste de análise de variância Kruskall-Wallis seguido pelo teste de múltiplas comparações de Dunn, não foram observadas diferenças estatísticas entre os três padrões do KIT em relação aos graus histológicos (p>0,05).

Tabela 8 - Grau histológico e padrão de expressão do CD117 nos tumores primários e nas metástases dos 19 cães.

Cão Grau I Grau II Grau III

KIT tumor primário KIT Metástase 4M X II III 5M X II III 10M X I I 17M X NRa III 34M X I III 53M X I I 57M X III NR 66M X I I 67M X II II 74M X II III 76M X III III 87M X II III 89M X III III 92M X I II 116M X I I 125M X III III 128M X I I 136M X NEGb _NEG 140M X I I

Gráfico 1 - Correlação entre o padrão KIT do tumor primário e das metástases em 16 animais. Tabela 9 - Grau histológico e expressão do CD117 dos 78 cães com diagnóstico de mastocitoma sem metástase.

A distribuição quanto à localização anatômica em relação ao grau histológico e ao padrão de expressão do CD117 dos 78 cães pode ser visualizada na tabela 17. Independente do padrão de expressão do CD117, a forma multicêntrica foi o sítio anatômico mais observado nos mastocitomas grau I. O mastocitoma grau II foi mais encontrado no tórax e na forma multicêntrica enquanto que o mastocitoma grau III teve sua maior localização no escroto e no membro posterior.

Independente do grau histológico os mastocitomas classificados como KIT I e KIT II tiveram a forma multicêntrica como sítio mais frequente. O abdômen foi o local mais encontrado nos mastocitomas padrão KIT III.

Nos animais com mastocitoma metastático o escroto foi o sítio anatômico mais frequente. Somente um cão (53M) com mastocitoma com metástase para linfonodos tinha a forma multicêntrica e, nesse caso, o escroto e o abdômen foram os locais presentes. A cabeça (orelha e lábio), tórax, abdômen, membro posterior e prepúcio foram os sítios anatômicos presentes no restante dos animais com metástase de mastocitoma.

4.3.2

Resultados

da

imuno-

histoquímica

dos

tumores

diagnosticados na histologia como

linfoma

Cerca de 88% (22/25) dos tumores diagnosticados histologicamente como

Diagnóstico histológico KIT I KIT II KIT III Total

Mastocitoma grau I 24(70,59%) 10(29,41%) --- 34(43,59%)

Mastocitoma grau II 16(59,26%) 7(25,93%) 4(14,81%) 27(34,62%)

Mastocitoma grau III 2(11,76%) 7(41,18%) 8(47,06%) 17(21,79%)

linfoma cutâneo foram submetidos à imuno- histoquímica. Os dados clínicos referentes à idade, a raça e ao sexo e os resultados da imuno-histoquímica de todos os animais com diagnóstico histológico de linfoma cutâneo estão contidos no apêndice 2. Dos 22 casos com diagnóstico histológico de linfoma cutâneo, 13 (59,09%) foram confirmados pela imuno-histoquímica e, o restante, não se tratava de linfoma (Tabela 10).

Os animais 7L, 8L, 11L, 13L, 14L, 21L e 22L tinham linfoma T epiteliotrópico CD3+

enquanto que os animais 9L, 16L e 17L foram classificados com linfoma T não- epiteliotrópico CD3+. A epiderme ulcerada nos casos 1L e 3L impossibilitaram a classificação dos linfomas de células T. Nos tumores dos animais 7L, 9L, 14L, 16L, 17L, 20L e 22L foram observadas marcação intensa pelo CD45. O restante, não mostrou sinal positivo para esse marcador. No tumor do animal 14L estavam presentes células inflamatórias, observadas pela marcação multifcal do anticorpo CD79a.

Tabela 10 - Casos com diagnóstico histológico de linfoma não confirmados pela imuno- histoquímica e seus respectivos diagnósticos finais.

A neoplasia do cão 2L consistia de um linfoma B com sinal positivo intenso para CD79a. Esse caso não mostrou marcação pelo CD45 e marcação multifocal pelo CD3 foi observada. Os casos 4L, 5L, 12L, 15L, 18L e 19L foram definidos como histiocitoma. Somente o animal 19L foi positivo para CD45. O restante (4L, 5L, 12L, 15L, 18L) foi negativo para CD45, CD3, CD79a e CD117. A negatividade para os três últimos marcadores afastou as possibilidades de linfoma T, linfoma B, plasmocitoma e mastocitoma. O padrão morfológico de células em cordão, partindo da epiderme, também foi observado nesses casos. A negatividade para citoqueratina AE1/AE3 afastou a possibilidade de o tumor ser de origem epitelial. Os casos 4L e 12L foram positivos para E-caderina. Apesar da falta de marcação para o CD45 e E-caderina em alguns desses casos, todos os tumores

foram definidos como histiocitomas cutâneos, pela associação entre os resultados da imuno-histoquímica que afastou as possibilidades de linfoma (T e B), plasmocitoma, mastocitoma e carcinoma indiferenciado e à morfologia celular compatível (células em cordão, perpendicular a epiderme, células com núcleo com invaginação lateral e citoplasma abundante.

Sarcoma histiocítico localizado estava presente no animal 6L que não apresentou sinal positivo para nenhum dos marcadores utilizados nesse estudo. Apesar disso, o diagnóstico foi feito pela associação dos resultados da imuno-histoquímica e pela morfologia das células neoplásicas.

O cão 10L não mostrou sinal positivo para os marcadores CD45, CD3 e CD79a. O tumor tinha aparência morfológica de uma

Tipo tumores Cães

Histiocitoma 4L 5L 12L 15L 18L 19L

Sarcoma histiocítico localizado 6L

Lipossarcoma 10L

neoplasia maligna de células redondas, porém, em algumas áreas observou-se que as células tinham citoplasma vacuolizado e, algumas vezes, o núcleo era achatado, na periferia da célula. Essas características, em conjunto com os resultados do painel de anticorpos possibilitaram o diagnóstico de lipossarcoma pobremente diferenciado. Mastocitoma padrão KIT III foi diagnosticado no animal 21L. Componente inflamatório (marcação multifocal do CD3 e CD79a) em quantidade acentuada estava presente nesse tumor e, provavelmente levou ao erro no diagnóstico.