Tükürük ve DOS örneklerinde IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, hs-CRP seviyelerinin ölçümleri Selçuk Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Araştırma Merkezinde yapıldı. İnceleme ELISA yöntemiyle (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α)8 ve hs-CRP9 için ticari ELISA kitleri kullanılarak gerçekleştirildi.
İşlemlerden önce tüm reaktifler, tükürük ve DOS örnekleri oda ısısına getirildi (18-25 ºC).
2.10.1. IL-1β Miktarının Belirlenmesi
Standartlar ikili çalışıldı. Kromojen blank hariç kuyucuklara 50 μl standart buffer konuldu ve üzerlerine 50 μl standart veya DOS/tükürük örneği eklendi. Kromojen blank hariç her kuyucuğa 100 μl biyotin konjugat ilave edildikten sonra
üzeri kapatılarak oda sıcaklığında 2 saat bekletildi. Sonrasında yıkama cihazında10 4
kere 400 μl yıkama solüsyonu kullanılarak yıkama yapıldı. Kromojen blank hariç tüm kuyucuklara 100 μl Streptavidin-horseradish peroksidase (HRP) solüsyonu konuldu ve üzeri kapatılarak 30 dk oda sıcaklığında bekletildi. Sonrasında 4 kere 400 μl yıkama solüsyonu kullanılarak yıkama yapıldı ve kuyucuklara 100 μl stabilize kromojen konulduğunda sıvının mavi renge dönüştüğü görüldü. Oda sıcaklığında ve karanlıkta 25 dakika bekleme sonrasında tüm kuyucuklara 100 μl stop solüsyonu eklendiğinde kuyucukların rengi sarı oldu. ELISA optik okuyucu cihazında 450 nm dalga boyunda okumalar yapıldı.
2.10.2. IL-6 Miktarının Belirlenmesi
Standartlar ikili çalışıldı. Uygun kuyucuklara 100 µl standart, kontrol ve örnekler eklendi. Sonra tüm kuyucuklara 50 µl biyotin konjugat eklendi ve plate üstü kapatılarak 2 saat oda sıcaklığında bekletildi. Bundan sonra plate yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkandı. Yıkamadan sonra tüm kuyucuklara 100 µl Streptavidin HRP solüsyonu eklendi ve üzeri kapatılarak yarım saat oda sıcaklığında bekletildi. Sonra yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkama yapıldı. Yıkamadan sonra her bir kuyucuğa 100 µl kromojenik solüsyon eklendi ve üzeri kapatılarak 30 dk karanlıkta oda sıcaklığında bekletildi. Sonra her bir kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu eklenerek ELISA optik okuyucu cihazında 450 nm dalga boyunda okutuldu.
2.10.3. IL-8 Miktarının Belirlenmesi
Standartlar ikili çalışıldı. Uygun kuyucuklara 50 µl standart, kontrol ve örnekler eklendi. Sonra tüm kuyucuklara 50 µl biyotin konjugat eklendi ve plate üstü kapatılarak oda sıcaklığında 1,5 saat bekletildi. Bundan sonra plate yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkandı. Yıkamadan sonra tüm kuyucuklara 100 µl Streptavidin HRP solüsyonu konuldu. Üzeri kapatılarak yarım saat bekletildi. Bundan sonra plate yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkandı. Yıkamadan sonra her bir kuyucuğa 100 µl kromojenik solüsyon eklendi ve üzeri kapatılarak 30 dk karanlıkta oda sıcaklığında bekletildi. Sonra her bir kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu eklenerek ELISA optik okuyucu cihazında7 450 nm dalga boyunda okutuldu.
2.10.4. IL-10 Miktarının Belirlenmesi
Standartlar ikili çalışıldı. Boş kuyucuklara kromojen blank hariç, 50 µl standart buffer eklendi. Sonra uygun kuyucuklara 50 µl standart ve örnekler eklendi ve plate üzeri kapatılarak oda sıcaklığında 2 saat bekletildi. Daha sonra kromojen blank hariç 100 µl biyotin konjugat her bir kuyucuğa pipet yardımıyla eklendi ve plate üzeri kapatılarak oda sıcaklığında 2 saat bekletildi. Daha sonra yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkama yapıldı. Yıkama işleminden sonra 100 µl streptavidin-HRP solüsyonu kromojen blank hariç her bir kuyucuğa eklendi ve plate üzeri kapatılarak 30 dakika oda sıcaklığında bekletildi. Yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkama yapıldı. Sonra 100 µl stabilize kromojen her bir kuyucuğa eklendi ve kuyucuklardaki solüsyonun mavi renge dönüştüğü gözlendi. Daha sonra plate karanlıkta ve oda sıcaklığında 30 dk bekletildi. Her bir kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu eklendi ve kuyucuklardaki solüsyonun sarı renge dönüştüğü gözlendi daha sonra plate, ELISA optik okuyucu cihazında 450 nm dalga boyunda okutuldu.
2.10.5. TNF-α Miktarının Belirlenmesi
Standartlar ikili çalışıldı. Yeterli sayıda kuyucuk hazırlandı. Standart ve örneklerin konulacağı tüm kuyucuklara 50 μl inkübasyon solüsyonu eklendi. Sırayla, kuyucuklara hazırlanan standart buffer dan 100 μl pipetle eklendi. Hazırlanan örneklerden 100’er μl pipetle eklendi. Plate’in üzeri kapatılarak oda sıcaklığında (18- 25 °C) 2 saat bekletildi. Bundan sonra plate açılarak 4 kez yıkama solüsyonu ile yıkandı. Tüm kuyucuklara 100 μl biyotin konjugat pipetle eklendi. Plate’in üzeri kapatılarak oda sıcaklığında (18-25 °C) mikroplate 1 saat bekletildi. Plate açılarak 4 kez yıkama solüsyonu ile yıkandı. Tüm kuyucuklara hazırlanan 100 μl Streptavidin- HRP pipetle eklendi. Plate’in üzeri kapatılarak oda sıcaklığında (18-25 °C) mikroplate 30 dk bekletildi. Plate açılarak 4 kez yıkama solüsyonu ile yıkandı. Tüm kuyucuklara 100 μl substrat solüsyonu pipetle eklendi. Plate 30 dk karanlıkta oda sıcaklığında bekletildi. Sonra 100 μl stop solüsyonu eklenerek reaksiyon sonlandırıldı. Daha sonra plate, ELISA optik okuyucu cihazında 450 nm dalga boyunda okutuldu.
Standart konsantrasyonları ve bu konsantrasyonlara ait absorbans değerleri ile standart eğri oluşturuldu. Bu eğri kullanılarak örnek absorbans değerlerinden konsantrasyon değerleri alındı.
2.10.6. Hs-CRP Miktarının Belirlenmesi
Standartlar ikili çalışıldı. Prosedür başladıktan sonra tüm adımlar kesintisiz olarak gerçekleştirildi. Anti-CRP-HRP konjugati ve yıkama solüsyonundan oluşan çalışma solüsyonu hazırlandı. Gerekli sayıda mikroplateler oluşturuldu. Uygun kuyucuklara 20 µl standart, kontrol ve seyreltilmiş örnekler pipetle eklendi. Her kuyuya çalışma solüsyonundan 200 µl eklendi (firma çok kanallı pipetle yapılmasını önermektedir). Oda sıcaklığında 30 dk süreyle plate karıştırıcıda (yaklaşık 200 rpm) bekletildi. Kuyu başına 300 µl lik seyreltilmiş yıkama tamponuyla 3’er kez tüm kuyular yıkaldı (yıkama makinası kullanımı önerilmektedir). Her kuyuya 100 µl konjugat çalışma solüsyonu pipetle aktarıldı (bu aşamada da firma çoklu pipet kullanımını önermektedir). Oda sıcaklığında 15 dk süreyle plate karıştırıcıda bekletildi. Tekrar kuyu başına 300 µl lik seyreltilmiş yıkama tamponuyla 3’er kez tüm kuyular yıkaldı. Belirli aralıklarla her kuyuya 100 µl substrat pipetle eklendi. Oda sıcaklığında 10-15 dk süre ile plate karıştırıcıda bekletildi. Substratın ilave edildiği zaman aralıklarında 50 µl stop solüsyonu da pipetle ilave edildi. Stop solüsyonu ilave edildikten 20 dk sonra ELISA optik okuyucu cihazında 450 nm dalga boyunda okuma işlemi yapıldı. Alınan değerler dilüsyon oranları ile çarpılarak gerçek konsantrasyonlara ulaşıldı.
2.11. Supra ve Subgingival Plak Örneklerinin Analizi