Su Tahliyesi Problemi için Neden Sonuç Diyagramı

Os cães foram os primeiros animais a serem domesticados, porém as pesquisas sobre a fisiologia básica ainda são escassas e necessárias. O cão é um ótimo modelo experimental tanto para aplicação de biotecnologias nas espécies selvagens, bem como para o estudo de algumas afecções nos homens.

O desenvolvimento na criação comercial de cães, assim como a conscientização da necessidade de preservação das espécies canídeas selvagens e o controle populacional de cães errantes impulsionaram as pesquisas no âmbito reprodutivo no mundo e no nosso país. É importante registrar que esse interesse maior é recente, cerca de 10 a 15 anos.

No Brasil, pesquisas nesta área iniciaram-se pela transferência de técnicas reprodutivas dos animais de produção para os caninos e pela importação de tecnologias, principalmente da Europa e dos Estados Unidos.

Embora muitas destas tecnologias possam ser aplicadas no Brasil, as diferenças ambientais devem ser consideradas. Uma questão importante é o conhecimento a respeito da atividade reprodutiva de cães machos criados no hemisfério sul, especificamente na região sudeste do Brasil. Esta região é caracterizada por mudanças ambientais pouco intensas, com pequenas alterações no fotoperíodo, cerca de duas horas e meia entre o solstício de

inverno e de verão e modificações maiores, centradas em temperaturas elevadas e índices pluviométricos, num determinado período do ano.

Embora o efeito do fotoperíodo provavelmente desapareça em animais que vivem abaixo da latitude 30º, além das variações de temperatura menos intensas, existe uma marcada variação estacional na precipitação pluviométrica (BRONSON & HEIDEMAN, 1994).

Todo mecanismo de controle endócrino da reprodução nos machos pode sofrer influência da sazonalidade (HAFEZ, 1987). A espermatogênese e a esteroidogênese são processos intimamente relacionados, mas ocorrem em áreas distintas dos testículos. A espermatogênese ocorre dentro dos túbulos seminíferos, que consistem de espermatogônias e células de Sértoli. E a esteroidogênese ocorre no tecido intersticial testicular, que é composto pelas células de Leydig. A libido e a produção espermática são dependentes do eixo hipotálamo – hipófise - testículos. Dois sistemas hormonais existem no trato reprodutivo dos machos, um envolvendo GnRH hipotalâmico - LH hipofisário – testosterona testicular e outro envolvendo GnRH - FSH hipofisário - inibina testicular (HEWITT, 1998).

A mensuração da testosterona sérica e concentração de gonadotrofinas proporcionam informações sobre o “status” funcional do eixo hipotalâmico - hipofisário - testicular (FELDMAN & NELSON, 2004).

Um dos animais do experimento apresentou um padrão hormonal muito díspare dos restantes e, para evitar uma distorção dos resultados, foi excluindo das análises posteriores. Esse cão apresentou um perfil totalmente diferente do outro da mesma raça, o que pode estar relacionado a diferenças

nos ritmos circadianos e circanuais (DEPALATIS et al., 1978).

Nesse estudo foi detectada uma diminuição significativa nas dosagens de testosterona no verão (1,31 ± 0,52 ng/mL), período de temperaturas ambientais mais elevadas e altos índices pluviométricos, quando comparado à primavera (1,93 ± 0,38 ng/mL) e ao outono (2,02 ± 0,98 ng/mL). Esses resultados concordam com os obtidos por FALVO et al. (1980) que observaram uma elevação significativa na concentração de testosterona no início do outono. A sazonalidade na produção de testosterona também foi descrita por HEWITT (1998), o qual verificou uma variação de 0,5 a 1,5 ng/mL e picos de 3,5 a 6,0 ng/mL, porém não mencionou as estações estudadas. Entretanto, TAHA et al. (1981) não detectaram variação sazonal relacionada às concentrações de testosterona ao avaliarem cães criados no hemisfério norte.

Os resultados do presente estudo mostraram uma variação sazonal dos níveis de testosterona dependente do índice pluviométrico (r=-0,86, p=0,059). Também foi visto uma variação individual importante entre os

animais, o que pode ser explicado pelo número pequeno de machos avaliados e, possivelmente, pelas diferenças raciais.

Uma das dificuldades ao estudar o perfil hormonal, além da variação individual, é a obtenção de um grande número de cães da mesma raça e submetidos ao mesmo manejo. Embora nesse estudo, com o intuito de diminuir os efeitos externos, os animais tenham recebido a mesma alimentação, mesmo manejo e as colheitas realizadas num mesmo horário e na mesma seqüência, ocorreu uma variação individual importante, também

descrita por TAHA et al. (1981).

Apesar de ter sido identificada uma variação sazonal nas concentrações de testosterona, os valores mínimos se mantiveram dentro da variação normal para a espécie, ou seja, houve uma diminuição nas concentrações de testosterona no verão, mas não o suficiente para caracterizar uma inatividade testicular. Fato que ocorre nas raposas azul e vermelha, que apresentam testículos pequenos e inativos durante o verão e outono (FORSBERG et al., 1989).

Nos machos adultos das raposas azul e vermelha a produção máxima de testosterona é coincidente com a estação reprodutiva (FARSTAD, 1998). A produção de testosterona também é mais pronunciada no período de primavera nos lobos prata (FORSBERG et al., 1989).

A concentração de testosterona intratesticular é cerca de 50 a 100 vezes maior que a testosterona sérica (FELDMAN & NELSON, 2004); isso significa que níveis baixos de testosterona sérica nem sempre estão relacionados com uma queda na produção espermática. Portanto, uma sazonalidade mais pronunciada poderia ser evidenciada na testosterona intratesticular.

Os resultados médios dos parâmetros seminais desse trabalho, no período de 14 meses, encontraram-se dentro dos valores normais para a espécie, com exceção da porcentagem de defeitos totais, que ficaram acima do aceitável pelo CBRA (20%). Durante todo o período avaliado a porcentagem média de células normais foi maior que 61%. Embora o número de células morfologicamente anormais tenha sido alto, acredita-se

que a fertilidade não tenha sido comprometida, pois segundo OETTLE (1993) a fertilidade é prejudicada quando a porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais está abaixo de 60%. Entretanto, somente os resultados da fertilidade in vivo desses cães é que pode avaliar o efeito das alterações de morfologia.

Nos cães diferentemente das espécies de produção, não existem estudos relacionando casos de subfertilidade ou infertilidade com porcentagens e classificação dos defeitos espermáticos. Neste estudo foi verificada uma porcentagem alta de defeitos maiores, localizados principalmente na cauda e peça intermediária das células espermáticas, nos cães da raça Springer Spaniel e defeitos de acrossoma nos da raça Golden Retrivier. Isso provavelmente pode estar relacionado a uma falta de controle

no planejamento genético desses animais.

Dentro das características seminais, somente a motilidade espermática foi diferente nos períodos estudados, entre a primavera de 2002 e o verão de 2003 houve um aumento significativo dessa variável (84,2% versus

89,6%).

As variações médias dos resultados das avaliações seminais encontradas neste trabalho, referentes aos resultados da avaliação seminal, foram semelhantes aos trabalhos realizados no hemisfério norte (KURODA & HIROE, 1972, TAKEISHI et al. 1975, TAHA et al., 1981) e superiores aos resultados encontrados por SCHÄFER et al. (1997). Essa variação pode ser devido às metodologias laboratoriais utilizadas.

(1975) foi observada uma queda na qualidade do sêmen no verão, contrariamente aos resultados do presente experimento, aos de TAHA et al. (1981) e SCHÄFER et al. (1997).

Diferentemente da maioria dos canídeos selvagens, que apresentam uma inatividade testicular na estação não reprodutiva das fêmeas (FARSTAD, 1998), os cães estudados permaneceram férteis durante todo o ano, da mesma forma que os eqüinos (HOFFMANN & LANDECK, 1999), ovinos (KARAGIANNIDIS et al., 2000a), caprinos (KARAGIANNIDIS et al., 2000b) e humanos (MALM et al., 2004). Existe uma interação complexa, entre o fotoperíodo e os mecanismos indutores endógenos que ocorrem dentro de cada espécie (GOODMAN, 1999).

Não foi encontrado na literatura consultada estudos relacionando o efeito da sazonalidade em cães com problemas de infertilidade, embora a sazonalidade tenha exercido um efeito deletério na qualidade do sêmen em estudos conduzidos em homens inférteis ou com fertilidade diminuída (CENTOLA & EBERLY, 1999, KÜNZLE et al., 2004).

Em relação à qualidade do sêmen após a criopreservação, foi observada uma variação individual intensa, sendo que alguns cães apresentaram resultados superiores a outros, durante todo o período experimental. Os animais das raças Golden Retrivier e Blood Hound mostraram melhores resultados na descongelação do sêmen do que os cães da raça Springer Spaniel. Esse resultado mostra que os cães apresentam um padrão homogêneo de resposta das células espermáticas ao estresse da criopreservação, independente da estação do ano considerada.

Ainda considerando a raça Springer Spaniel, foi observada uma porcentagem alta de inserção abaxial da peça intermediária. Embora MIES FILHO (1987) não considere este um defeito espermático em eqüinos e caninos, essa alteração na morfologia da célula espermática poderia ser responsável por uma fragilidade maior dos espermatozóides quando submetidos ao estresse da criopreservação.

Quando se realizou comparação individual, foi evidenciado animais que demonstraram resultados opostos, um cão da raça Golden Retrivier apresentou os melhores resultados na descongelação do sêmen durante todo o ano (72% motilidade e 56% de células íntegras) e um cão da raça Springer Spaniel os piores resultados (28% motilidade e 26% de

células íntegras).

As médias dos resultados da descongelação evidenciaram diferença significativa na variável vigor espermático, com valores menores no outono de 2003, quando comparado com o verão de 2003 (2,4 versus 2,8). Foi verificada também uma tendência à diminuição em todas as outras variáveis avaliadas (motilidade 54,9% versus 44,0%, membranas íntegras 44,6% versus 37,2%).

Os melhores resultados na descongelação de sêmen neste trabalho foram obtidos no período do verão, resultados diferentes àqueles obtidos em lobos prata (FORSBERG et al., 1989), em búfalos (BAHGA & KHOKAR, 1991) e em eqüinos (JANETT et al., 2003a, 2003b).

Os resultados médios das mensurações testiculares e prostáticas não apresentaram variações sazonais significativas no período estudado. Porém,

os animais de porte menor (15 kg) apresentaram valores de volumes prostáticos e testiculares mais baixos e os de maior porte (45 kg) valores mais altos. Esses resultados estão de acordo com aqueles relatados por OLAR et al. (1983), AMANN (1986), HEWITT (1998) onde a massa testicular tem relação direta com o peso corpóreo.

Durante o período do estudo foi diagnosticado prostatite em um e hiperplasia prostática em outro animal da raça Springer Spaniel, afecções prostáticas que elevam as mensurações da glândula; esse fato pode ter mascarado as modificações sazonais que eventualmente tenham ocorrido durante as estações climáticas nos 14 meses de estudo.

Nos meses de verão, período em que foi detectada queda na concentração de testosterona, pôde ser observada, avaliando–se individualmente os cães, uma tendência à diminuição no volume prostático em seis dos oito animais, exceção foram os dois cães que apresentaram a prostatite e a hiperplasia prostática. Os volumes testiculares não apresentaram variações durante o todo o período considerado.

Os resultados nas mensurações da próstata e testículos são coerentes com os resultados das avaliações do sêmen, que também não sofreram alterações sazonais durante o período estudado, confirmando os resultados das mensurações encontrados por JOHNSON et al. (1994), WALKER (1999) e em ovinos por BICUDO (1998).

O plasma seminal exerce um importante papel na maturação do espermatozóide, através de processos enzimáticos e de modificação da superfície espermática. O plasma seminal contém uma variedade de

componentes bioquímicos, muitos dos quais são relativamente específicos para a regulação da função espermática (PÉREZ-PÉ et al., 2001b).

Em relação aos componentes bioquímicos do plasma seminal, as médias nos períodos estudados identificaram variações sazonais nas concentrações de cloretos totais e magnésio. Foi observada uma diminuição nos valores de cloretos totais no verão em relação ao inverno de 2002 (151,9 versus 156,2). As concentrações deste eletrólito neste estudo foram superiores às obtidas por BARTLETT (1962) e inferiores às descritas por SOUZA (2003).

PANGAWKAR et al. (1988) relataram que os cloretos presentes no plasma seminal de bovinos se ligam à membrana do espermatozóide tornando-os vulneráveis às agressões externas. Nesse experimento foi identificada uma queda da concentração de cloretos no verão, período no qual a motilidade espermática foi maior. Portanto, sugere-se que os cloretos totais do plasma seminal de cães também exerçam um efeito deletério nas células espermáticas desta espécie.

Um aumento significativo foi evidenciado nas concentrações de magnésio nos períodos de outono e inverno de 2003 em relação ao inverno de 2002 (3,34 mg/L e 3,42 mg/L versus 2,70 mg/L). As concentrações de magnésio deste estudo foram maiores que as detectadas por BARTLETT (1962) e CHATTERJEE et al. (1976). Embora somente entre essas três estações as diferenças nas concentrações de magnésio tenham sido significativas, pôde ser observado um aumento crescente deste eletrólito no plasma seminal durante o período estudado. Estudos têm relacionado as

concentrações de magnésio do plasma seminal ao transporte espermático (OMU et al., 2001), entretanto nesse experimento não foi identificado um efeito direto deste eletrólito nos parâmetros avaliados do sêmen.

Neste estudo, foi observada uma tendência de diminuição no verão, nas concentrações médias de sódio (142,9 mmol/L) e potássio (8,85 mmol/L) no plasma seminal, período este onde foram identificados

resultados superiores na motilidade espermática do sêmen a fresco (54,9%). Esses resultados concordam com as conclusões de YUMURA et al.

(2002) que altas concentrações de sódio e potássio exercem um efeito deletério na motilidade espermática em homens.

A metodologia utilizada para as dosagens dos componentes bioquímicos foi semelhante à usada por SOUZA (2003), porém os resultados obtidos nesse experimento foram diferentes. Foi observado que as concentrações de potássio, cloretos totais e cálcio, foram menores que as obtidas por SOUZA (2003) e as concentrações de proteínas totais e sódio maiores. Essa diferença pode ser explicada pelas condições de manejo dos animais, pois SOUZA (2003) trabalhou com cães sem raça definida, e antecedentes desconhecidos, enquanto que os animais deste estudo possuíam manejo e nutrição adequados e excelente estado corpóreo.

Na avaliação do perfil eletroforético das proteínas do plasma seminal foram identificadas um total de 31 bandas, com pesos moleculares entre 139,63 kDa e 2,71 kDa. Esses resultados diferem dos de SOUZA (2003), que identificou 37 bandas com variações entre 100,6 kDa e 3,6 kDa.

cães) estudado por SOUZA (2003), uma vez que em trabalho de SOUZA & LOPES (2002) com cinco animais foram identificadas apenas 25 bandas no plasma seminal, com densitometria entre 136 kDa e 3,5 kDa; possivelmente o número de bandas varia entre os animais. Provavelmente, se o experimento fosse conduzido com uma amostragem maior, seria identificado um número mais elevado de bandas.

Não foram detectadas variações sazonais no perfil protéico do plasma seminal nos cães estudados, diferente dos resultados obtidos em ovinos por PÉREZ-PÉ et al. (2001).

Uma banda (31,38 kDa) do perfil eletroforético do plasma seminal apresentou uma correlação negativa (r=-0,58) com temperatura máxima. SOUZA (2003) relatou que após a vasectomia, duas bandas, de 42,6 kDa e 29,2 kDa não foram identificadas no perfil protéico do plasma seminal, sugerindo que estas poderiam ser provenientes da rede de túbulos testiculares.

Considerando a proximidade dos pesos moleculares entre estas bandas (31,38 kDa e 29,2 kDa), sugerimos que a banda encontrada nesse estudo pode ser a mesma identificada por SOUZA (2003).

Uma evidência importante nessa correlação seria que a influência negativa da temperatura sobre essa proteína poderia explicar uma diminuição, estatísticamente não significativa, no número de espermatozóides/mL refletida no período posterior às altas temperaturas (73,81x106/mL no verão versus 66,30x106/mL no outono).

banda 19 (15,29 kDa). Somente um animal, dos oito estudados, apresentou densitometria baixa desta banda, foi um animal da raça Golden Retrivier, o qual apresentou resultados superiores na avaliação pós-congelação de sêmen.

SOUZA (2003) identificou no plasma seminal, antes e após a vasectomia, uma banda de peso molecular semelhante (15,6 kDa) com alta densitometria e sugeriu que esta banda pode representar uma das subunidades da arginina esterase, que compõe 90% do total de proteínas do fluído prostático de cães (ISSACS & SHAPER, 1985). A banda encontrada nesse estudo (15,29 kDa) pode ser a mesma banda.

Com relação ao cão Golden Retrivier que apresentou a banda 15,29 kDa com baixa densidade óptica e boa congelabilidade do sêmen, sugere-se que esta banda encontra-se em baixa concentração no plasma seminal deste animal, pois pode estar ligada à membrana espermática, protegendo-a do estresse da criopreservação.

A banda 15,59 kDa identificada neste estudo apresentou uma correlação positiva (r=0,20, r=0,26 e r=0,29; respectivamente) com motilidade espermática pré e pós-congelação, e integridade de membrana pós-descongelação. Apresentou também uma densidade óptica alta e constante durante todo o período experimental, podendo em estudos posteriores ser pesquisada como um possível marcador de fertilidade e ou alta congelabilidade em cães.

Estes resultados complementam os obtidos por SOUZA (2003) que identificou uma correlação positiva entre a densidade óptica das bandas de 67 kDa e de 58,6 kDa e motilidade, vigor, porcentagem de células espermáticas

normais e integridade de membrana no sêmen a fresco.

Ficou evidente na literatura consultada a escassez de trabalhos relacionados à sazonalidade reprodutiva na espécie canina. Este fato motivou o início desse projeto, na busca de estabelecer padrões estacionais na função testicular e promover uma melhor utilização deste conceito na reprodução de cães.

Após o término desse experimento ficou claro que existe uma influência do ambiente sobre os aspectos reprodutivos, entretanto, esse efeito é menor do que o esperado, provavelmente, devido à metodologia utilizada.

Acredita-se que interações hormonais entre os metabólitos da testosterona, tiroxina, cortisol e prolactina devam ocorrer, o estudo desses pode proporcionar informações mais seguras a respeito da síntese de hormônios esteróides nas estações.

A avaliação seminal bem como as interações da célula espermática com o plasma seminal sugeriram um efeito da estacionalidade na espermatogênese. Também neste caso, seria interessante a realização de testes mais específicos, como a eletroforese bidimensional. A isoeletrofocalização traria maiores informações das proteínas, para se confirmar as alterações sazonais.

Deve ser considerado que aspectos da domesticação da espécie influenciaram na diminuição dos efeitos da sazonalidade reprodutiva e, acredita-se que somente um conhecimento profundo sobre a fisiologia reprodutiva da espécie canina poderia incrementar os resultados obtidos na criopreservação de gametas, obtenção de embriões e, conseqüentemente no

aprimoramento da criação comercial de cães e preservação das espécies ameaçadas de canídeos selvagens.