Sterilizasyon Tekniklerinin Geliştirilmesi Çalışmaları

Araştırma kapsamındaki sterilizasyon çalışmalarında, %53 NaOCl içeren (Axion) ticari sterilanta yer verilmiştir. Tüm sterilizasyon işlemleri röpikaj odasında yapılmış olup, çalışmalarda genellikle cam deney tüpleri kullanılmıştır. Standart MS besi ortamına 30 gl-1 sukroz ve 6.3 gl-1 agar ilave edilerek, BBD’siz olarak hazırlanmıştır. Ekim yapılan kültür kapları Bölüm 3.2.3.’te belirtilen büyüme odasında gelişmeye bırakılmıştır.

Tüm sterilizasyon çalışmalarında yapılan gözlemler ve alınan ölçümler şöyledir;

Enfekte olan kültür (%); kültürlerin gelişmeleri dikkate alınarak 28 günlük kültür sonunda, enfekte olan kültür sayısının tüm kültürlere oranı hesaplanarak yüzde olarak ifade edilmiştir.

Çimlenen tohum (%); olgun kayısı tohumlarının 28 günlük kültürü sonunda, çimlenen tohum sayısının, tüm tohumlara oranı hesaplanarak yüzde olarak ifade edilmiştir.

Gelişen kültür (%); kültürün 28. gününe kadar enfekte olmadan gelişen kültür sayısının, tüm kültürlere oranı hesaplanarak yüzde olarak ifade edilmiştir.

Aşırı steril kültür (%); kültürün 28. gününe kadar herhangi bir gelişme olmayıp, kahverengileşerek bozulan kültür sayısının, tüm kültür sayısına oranı hesaplanarak yüzde olarak ifade edilmiştir.

3.2.6.1. Kayısı Tohumlarının Sterilizasyonu

3.2.6.1.1. Kayısı Tohumlarının Sterilizasyonuna NaOCl’nin Farklı Konsantrasyonlarının Etkisi

Bu deneyde “Hacıhaliloğlu” kayısı tohumlarının sterilizasyonu ve in vitro çimlenmesi üzerine NaOCl’nin farklı konsantrasyonlarının etkisi incelenmiştir. Endokarpı çekiçle kırılarak hazırlanmış kayısı tohumları yüzey sterilizasyonundan önce 3-5 dakika steril saf suda yıkandıktan sonra %70’lik alkol içerisinde 40 sn’lik bir ön sterilizasyona tabi tutuldu. Daha sonra NaOCl’nin %5, 10, 15 ve 20’lik konsantrasyonlarından hazırlanmış solüsyonlar içerisinde bir kontrol grubuyla birlikte 30 dakika çalkalandılar. Sterilizasyonu tamamlanan tohumlar, her tekrarda 5 dakika olmak üzere 5 defa steril saf su içerisinde çalkalanarak sterilantın etkisi giderildi. Tohum üzerindeki testanın soyulmasını kolaylaştırmak için 1 saat süreyle steril saf suda bekletildi. Steril kabin içerisine alınan tohumların testası uzaklaştırıldıktan sonra, kurutma kağıdı üzerinde kurutularak hormonsuz MS besi ortamında kültüre alındı.

3.2.6.1.2. Kayısı Tohumlarının Sterilizasyonuna %5’lik NaOCl’te Farklı Bekletme Sürelerinin Etkisi

Bu deneyde “Hacıhaliloğlu” kayısı tohumlarının sterilizasyonu ve in vitro çimlenmesi üzerine NaOCl’nin farklı bekletme sürelerindeki etkisi incelenmiştir. Endokarpı çekiçle kırılarak hazırlanmış kayısı tohumları yüzey sterilizasyonundan önce 3- 5 dakika steril saf suda yıkandıktan sonra %70’lik alkol içerisinde 40 sn’lik bir ön sterilizasyona tabi tutuldu. Daha sonra NaOCl’nin %5’lik konsantrasyonunda 10, 15, 20 ve 30 dakika süreyle bir kontrol grubuyla birlikte bekletildi. Sterilizasyonu tamamlanan tohumlar her tekrarda 5 dakika olmak üzere 5 defa steril saf su içerisinde çalkalanarak sterilantın etkisi giderildi. Tohum üzerindeki testanın soyulmasını kolaylaştırmak için 1 saat süreyle steril saf suda bekletildi. Steril kabin içerisine alınan tohumların testası uzaklaştırıldıktan sonra, kurutma kağıdı üzerinde kurutularak hormonsuz MS besi ortamında kültüre alındı.

3.2.6.2. Kayısı Ağaçlarından Alınan Nodal Tomurcukların Sterilizasyonu

3.2.6.2.1. Nodal Tomurcukların Sterilizasyonuna NaOCl’nin Farklı Konsantrasyonlarının Etkisi

Bu deneyde kayısı ağaçlarından alınan nodal tomurcukların sterilizasyonu üzerine NaOCl (Sodyum hipoklorit)’in farklı konsantrasyonlarında 30 dakikalık bekletme süresinin

etkisi incelenmiştir. Kayısı ağaçlarından alınan sürgünler, laboratuvarda tek tomurcuk bulunduran 2-3 cm’lik küçük çelikler halinde kesilerek, musluk suyunda 3-5 dakika yıkandıktan sonra, %70’lik alkol içerisinde 40 sn bekletildi. Daha sonra NaOCl’nin %5, 10, 15 ve 20’lik konsantrasyonlarından hazırlanmış sterilantlarda kontrol grubuyla birlikte her 2-3 dakikada bir sallanarak 30 dakika bekletildi. Sterilizasyonu tamamlanan materyaller, her tekrarda 5 dakika olmak üzere 5 defa steril saf su içerisinde çalkalanarak sterilantın etkisi giderildi ve son aşamada steril distile su içerisinde bekletildi. Bu işlemden sonra steril kabin içinde kurutma kağıdı üzerinde kurutulan çelikler, 0.5-1 cm uzunluğunda kesilerek hormonsuz MS besi ortamında kültüre alındı.

3.2.6.2.2. Nodal Tomurcukların Sterilizasyonuna %5’lik NaOCl’te Farklı Bekletme Sürelerinin Etkisi

Bu deneyde, kayısı ağaçlarından alınan nodal tomurcukların sterilizasyonu üzerine %5’lik NaOCl’nin farklı bekletme sürelerinin etkisi incelenmiştir. Kayısı ağaçlarından alınan sürgünler, laboratuvarda tek tomurcuk bulunduran 2-3 cm’lik küçük çelikler halinde kesilerek, musluk suyunda 3-5 dakika yıkandıktan sonra, %70’lik alkol içerisinde 40 sn bekletildi. Daha sonra %5’lik NaOCl içerisinde 5, 10, 20 ve 30 dakika süreyle kontrol grubuyla birlikte 2-3 dakikada bir sallanarak bekletildi. Sterilizasyonu tamamlanan materyaller, her tekrarda 5 dakika olmak üzere 5 defa steril saf su içerisinde çalkalanarak sterilantın etkisi giderildi ve son aşamada steril saf su içerisinde bekletildi. Bu işlemden sonra steril kabin içinde kurutma kağıdı üzerinde kurutulan çelikler 0.5-1 cm uzunluğunda kesilerek hormonsuz MS besi ortamında kültüre alındı.

3.2.6.3. Kayısı Ağaçlarından Alınan Sürgün Uçlarının Sterilizasyonu

3.2.6.3.1. Sürgün Ucu Sterilizasyonuna NaOCl’nin Farklı Konsantrasyonlarının Etkisi

Bu deneyde, kayısı ağaçlarından alınan sürgün ucu materyalinin sterilizasyonu üzerine NaOCl’nin farklı konsantrasyonlarının etkisi incelenmiştir. Deneyde kullanılacak sürgün uçları; ağaçlar üzerindeki tomurcukların patlamasından itibaren ve yaklaşık olarak 2-5 yaprak açıldıktan sonra alındı. Laboratuvara getirilen materyaller, musluk suyunda 3-5 dakika yıkanarak 30 sn süreyle %70’lik alkolde çalkalandı ve steril saf sudan geçirildikten sonra %5-10-15 ve 20’lik NaOCl konsantrasyonlarından hazırlanmış solusyonların içerisine bir kontrol grubuyla birlikte bırakıldı. Burada 20 dakika bekletildikten sonra her defasında 5 dakika olmak üzere 5 defa steril saf suda çalkalandı. Sterilizasyonu

tamamlanan materyaller, steril kabin içerisine alınarak, en uç kısımda bir yaprakçık ve sürgün ucu taslağı kalacak şekilde etrafı iyice temizlendi. Bu şekilde kurutma kağıtları üzerinde kurutulduktan sonra 1 mgl-1 BAP içeren MS besi ortamında kültüre alındı.

3.2.6.3.2. Sürgün Ucu Sterilizasyonuna %10’luk NaOCl’te Farklı Bekletme Sürelerinin Etkisi

Bu deneyde, kayısı ağaçlarından alınan sürgün ucu materyalinin sterilizasyonu üzerine %10’luk NaOCl’te farklı bekletme sürelerinin etkisi incelenmiştir. Deneyde kullanılacak sürgün uçları; ağaçlar üzerindeki tomurcukların patlamasından itibaren ve yaklaşık olarak 2-5 yaprak açıldıktan sonra alındı. Laboratuvara getirilen materyaller, musluk suyunda 3-5 dakika yıkanarak 30 sn süreyle %70’lik alkolde çalkalandı ve steril saf sudan geçirildikten sonra %10’luk NaOCl konsantrasyonu içerisinde 10, 15, 20, 25 ve 30 dakikalık sürelerle ayrı ayrı bekletildi. Daha sonra her defasında 5 dakika olmak üzere 5 defa steril saf suda çalkalandı. Sterilizasyonu tamamlanan materyaller, steril kabin içerisine alınarak, en uç kısımda bir yaprakçık ve sürgün ucu taslağı kalacak şekilde etrafı iyice temizlendi. Bu şekilde kurutma kağıtları üzerinde kurutulduktan sonra 1 mgl-1 BAP içeren MS besi ortamında kültüre alındı.