Alev Sprey Kaplama Tekniği

Essa etapa teve por finalidade identificar mecanismos moleculares envolvidos nas respostas de genótipos de sorgo à exposição isolada ou combinada de estresse salino e temperatura elevada. Os experimentos foram conduzidos de modo idêntico ao descrito nos itens 6.1 e 6.3.1. As coletas foram realizadas após 12 h da aplicação dos tratamentos de estresse.

63 6.4.1 Extração e avaliação da qualidade do RNA Total

Amostras de tecidos foliares das plantas de todos os tratamentos foram coletadas, congeladas em nitrogênio líquido, e armazenadas a -80oC. O RNA total foi extraído utilizando o "kit" "NucleoSpin RNA Plant” (MACHEREY-NAGEL), de acordo com as recomendações do fabricante. Durante a extração, o RNA total foi tratado com DNase (MACHEREY-NAGEL) para eliminar contaminações com DNA genômico.A quantificação do RNA foi realizada através de leituras espectrofotométricasa 260 nm usando o Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Para estimar a pureza do RNA total,utilizou-se a razão de 260/280 nm de absorbância para identificar contaminações por proteínas (valores ideais entre 1,8 a 2), bem como a razão 260/230 nm de absorbância para determinar contaminações por polissacarídeos (valores ideais acima de 2). A integridade do RNA total foi avaliada através de eletroforese em gel de agarose a 1,5 %. A quantidade e qualidade do RNA também foi avaliada através do Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), que fornece valores do RIN (RNA integrity number). Os valores RIN são calculados a partir de um algoritmo que leva em consideração as razões 28S:18S, com valor máximo igual a 10.Nesse tipo de análise, quanto maior o valor do RIN, maior a integridade do RNA (SCHROEDER, et al., 2006).

6.4.2 Análise transcriptômica via RNA – seq

6.4.2.1 Preparo das bibliotecas de cDNA e sequenciamento

O sequenciamento das amostras foi feito na empresa CD Genomics (Shirley, NY, USA). Basicamente, o RNA foi purificado a partir de 1µg de RNA total, utilizando sondas biotiniladas que se ligam seletivamente aos RNAsribossômicos e que estão presentes no Kit TruSeq Stranded Total RNA with Ribo – zero Plant (Illumina, San Diego, CA, USA).O RNA selecionadofoi então fragmentado na presença de tampão de fragmentação 5X (contendo cátions divalentes) e submetido a 94 o_{C por 5}

minutos. Posteriormente, a dupla fita de cDNA foi sintetizada usando primers randômicos (N6) e o kit SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis (Invitrogen). Em seguida, adaptadores presentes no kit da Illumina“TruSeq RNA-seq Sample Preparation v2”foram ligados em ambas as extremidades dos fragmentos de cDNA para amplificação e sequenciamento do cDNA. Os fragmentos de 300 a 400pb (pares de bases), correspondentes ao cDNA ligado aos adaptadores, foram

64 separados dos adaptadores não ligados através de eletroforese em gel de agarose a 2 %.

Aqualidade das bibliotecas foi avaliada através do Bioanalyzer 2100, por meio do uso do kit Agilent DNA 1000(Agilent Technologies).As bibliotecas de cDNA foram enriquecidas através de 15 ciclos de PCR de ponte em fase sólida, reunidas em concentração equimolar, e sequenciadas através da plataforma Illumina HiSeq2000usando o Kit Truseq SBS (v3) (Illumina, San Diego, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante. A estratégia empregada foi a de sequenciamento a partir de ambas as extremidades (paired-end) com fragmentos de 2 × 150 pares de bases.

6.4.2.2 Análises de bioinformática

6.4.2.2.1 Análise das sequências e mapeamento

Inicialmente, as sequências provenientes do sequenciamento (reads) foram avaliadas qualitativamente através do programa FastQC(ANDREWS, 2010). As sequências contendo bases nucleotídicas de baixa qualidade (Phred scoremenor que 20) foram filtradas por meio do programa Trimmomatic (BOLGER et al., 2014)e eliminadas das etapas posteriores. Já as sequências (reads) compostas de bases nucleotídicas com alta qualidade foram selecionadas e alinhadas contra o genoma

de referência do

sorgo(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=sorghum+bicolor)através das ferramentas TopHat (http://tophat.cbcb.umd.edu/) (TRAPNELL et al., 2009) e Bowtie(http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) (LANGMEAD et al., 2009). O TopHat é um mapeador do tipo splice junction, que usa o programa “Bowtie aligner” para alinhar as leituras ao genoma de referência. Através desse programa (TopHat) é possível identificar e resolver possíveis splicing alternativos.

6.4.2.2.2 Mensuração dos níveis de expressão e identificação dos genes diferencialmente expressos (GDEs)

Após mapeamento, foram geradosarquivos com contagens das reads (arquivo counts) para cada gene, os quais foram filtrados quanto ao número de contagens pelo método de CPM (contagens por milhão). Nessa ocasião, os genes que apresentaram contagens baixas (< 1,0)em pelo menos duas das oito bibliotecas

65 foram removidos das análises subsequentes. Por fim, as contagens foram normalizadas através do método TMM (Trimmed Mean of M-values) (ROBINSON; OSHLACK, 2010).

Em seguida, os níveis de expressão e a análise dos GDEs foram determinados através do pacote do Cufflinks v2.0.2(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/) (TRAPNELL et al., 2009), o qualinclui as ferramentas Cufflinks (utilizada para montagem de transcritos e normalização dos níveis de expressão), Cuffmerge (empregada na montagem do transcriptoma final) e Cuffdiff (usada para calcular os níveis de expressão diferencial). O pacote Cufflinks usa o método de contagem defragmentos por kilobase de transcrito por milhão de fragmentos mapeados(FPKM) (TRAPNELL et al., 2009). Durante as análises, o p-value menor que 0,05 foi utilizado na ferramenta Cuffdiff para inferir os genes diferencialmente expressos. Por fim, a tabela de contagem contendo os valores de FPKM dos GDEs identificados foi usada para a construção dos MA plots e diagramas de Venn utilizando o software R v. 3.3.2(ROBINSON, et al., 2010).

6.4.2.2.3 Anotação dos genes diferencialmente expressos (GDEs)

Os genes diferencialmente expressos (GDEs) foram anotados por meio de buscas com a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) (ALTSCHUL et al., 1997) utilizando os seguintes bancos de dados de proteínas: non-redundant protein sequences (nr) ereference proteins (refseq-protein). Para os transcritos ainda não identificados foram feitas buscas adicionais nos seguintes bancos de transcritos: Expressed Sequence Tags (ESTs), Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) e Reference RNA sequence (Refseq-RNA).

Os GDEs foram classificados, de acordo com a Ontologia Gênica (GO), nas categorias componente celular, processo biológico e função molecular através do programa GO seq (v. 1.24.0) (YOUNG et al., 2010), implementado no pacote Rv 3.3.2.As categorias do GO enriquecidas (que apresentavam p-value< 0,05) foram calculadas utilizando-se a aproximação de Wallenius (WALLENIUS, 1963).

As vias metabólicas dos GDEs foram determinadas através do servidor KAAS [KEGG Automatic Annotation Server (MORIYA et al., 2007; KANEHISA et al., 2000)] (http:/www.genome.jp/tools/kaas/), usando o método bidirectional best hit(BBH). O

66 KAASfornece a anotação funcional de genes usando o BLAST contra o banco de dados do KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). O KAAS fornece o KO (KEGG Orthology), que é um identificador automatizado,usado para identificar as propriedades funcionais e os papéis biológicos dos GDEs (MORIYA et al., 2007). 6.4.3Validação dos dados transcriptômicos através de qPCR

6.4.3.1 Seleção de genes para validação e desenho de primers

Os dados oriundos da análise transcriptômica foramvalidados utilizando a técnica de qPCR. Inicialmente, foram selecionados os genes que apresentaram expressão diferencial (Log2 fold change ≤ -1/ ≥ 1), os quais foram identificados como cruciais nas respostas de tolerância aos estresses estudados. Vale ressaltar que Log2 fold change = -1 ou 1 representam, respectivamente,modulação de expressão negativa e positiva em torno de 2 vezes (ROBINSON; OSHLACK, 2010). Em seguida, primers específicos foram desenhados usando as sequências depositadas nos bancos de dados, bem como aquelas provenientes do sequenciamento dos RNAs. Os primers para os genes GTPB, UBC 18, EF1 α, UK, EF1β 2, F-box e SAND foram desenhados e analisados empregando as ferramentas “Perl primer”

(MARSHALL, 2004) e “oligo analyzer da IDT”

(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/), respectivamente. Por fim, a estabilidade de expressão para os genes de referência foi investigada através do programa GeNormv 2.1(VANDESOMPELE et al., 2002). A tabela 1 apresenta as sequências dos primers empregados no presente estudo.

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Tabela 1 -Identificação do gene, número de acesso, produto gênico, sequência dos iniciadores, temperatura de anelamento e tamanho

do produto amplificado dos genes empregados nas análises de qPCR.

Gene Número de acesso Produto gênico Sequência do primer (5’-3’) Temperatura de