Genel Sonuçlar

Os dados de quantificação e integridade dos RNAs demonstaram que as amostras apresentaram excelente qualidade (Dados não mostrados), com concentrações variando entre 346,6 e 1210,5 ng/μL, e relações 260/280 e 260/230 apresentando valores em torno de 2 e acima de 2, respectivamente. Adicionalmente, os perfis dos géis de agarose a 1,5% demonstraram que os RNAs estavam íntegros, visto que as bandas do RNA ribossomal referentes às subunidades 18S e 28S foram visualizadas (Figura 45).

Figura 45. Análise da integridade do RNA total em gel de agarose (1,5 %),

evidenciando as bandas do RNA ribossomal 18S e 28S. As amostras foram extraídas de folhas de plantas de sorgo, genótipos CSF20 (1-3, 7-9, 13-15 e 19-21) e CSF18 (4-6, 10-12, 16-18 e 22-24). Raias 1-3: controle CSF20; Raias 4-6: controle CSF18; Raias 7-9: estresse salino CSF20; Raias 10-12; estresse salino CSF18; Raias 13-15: temperatura elevada CSF20; Raias 16-18: temperatura elevada CSF18; Raias 19-21: estresse combinado CSF20; Raias 22-24: estresse combinado CSF18.

169 7.4.2 Qualidade do cDNA obtido pela reação de transcrição reversa

A qualidade do cDNA produzido via transcrição reversa foi verificada através de PCR semi - quantitativa, usando todas as amostras de cDNA produzido. A banda referente ao amplicon do gene EF1β 2, usado para as reações, foi evidenciada nas diferentes amostras analisadas, demonstrando boa qualidade do cDNA produzido (Figura 46).

Figura 46. Eletroforese em gel de agarose (2 %) dos produtos de amplificação, via

PCR semi - quantitativa, do gene do fator de elongação 1 beta 2 (EF1β 2) para avaliação da qualidade do cDNA. As amostras foram extraídas de folhas de plantas de sorgo, genótipos CSF20 (1-3, 7-9, 13-15 e 19-21) e CSF18 (4-6, 10-12, 16-18 e 22-24). Raias 1-3: controle CSF20; Raias 4-6: controle CSF18; Raias 7-9: estresse salino CSF20; Raias 10-12; estresse salino CSF18; Raias 13-15: temperatura elevada CSF20; Raias 16-18: temperatura elevada CSF18; Raias 19-21: estresse combinado CSF20; Raias 22-24: estresse combinado CSF18.

Fonte: elaborado pelo autor.

7.4.3 Temperatura de anelamento e especificidade dos primers

A temperatura de anelamento empregada nos ensaios de qPCR foi selecionada com base nos ensaios de gradiente de temperatura. Para cada par de primer,as temperaturas selecionadas são apresentadas na Tabela 1.

Vale ressaltar que a análise das curvas de dissociação mostrou a presença de um único pico, evidenciando que apenas um produto gênico foi amplificado e que não houve formação de dímeros de primers(dados não mostrados). A especificidade dos primerstambém foi confirmada através de eletroforese em gel de

170 agarose 2 %, onde se observou a presença de um único fragmento, com tamanho de amplicon esperado para todos os genes testados(dados não mostrados).

7.4.4 Análises da estabilidade de expressão dos genes candidatos a normalizadores

A média de estabilidade de expressão gênica (valor M) foi calculada através do software GeNorm, considerando um valor M abaixo do limite de 1,5, com o intuito de identificar (conjuntos de) genes de referência com expressão estável para cada condição estudada. Os resultados mostraram que todos os genes apresentaram um valor M menor que o limite de corte de 1,5(Figura 47A) e que dois genes (Fbox e SAND) foram suficientes para a normalização dos dados de qPCR, utilizando a variação Vabaixo do valor de corte (0,15) sugerido pela literatura (Figura 47B) (VANDESOMPELE et al., 2002).

Figura 47. Estabilidade de expressão dos 7 candidatos a genes de referência,

considerando os dois genótipos de Sorghum bicolor e as diferentes condições experimentais: Controle (CONT), NaCl (SAL), temperatura elevada (TE) e na combinação de NaCl + Temperatura elevada (COMB). (A) Classificação fornecida pelo GeNorm para os candidatos a genes de referência. Genes com os menores valores M são os mais estáveis. (B) Gráfico dos valores V fornecidos pelo GeNorm para os sete candidatos a genes de referência.

171 7.4.5Análise de expressão diferencial via qPCR

De modo geral, o padrão de modulação dos genes obtido nos ensaios de RNA-seq foi quase idêntico ao perfil obtido nos ensaios de qPCR. Ou seja, o padrão de expressão dos genes PYL4, bZIP, DEAD-box ATP-dependente RNA helicase 52B, RBCS1A, CAT1, MDHAR, MKK2, WRKY60, CRT1 e HSP23.6-MITOmostrou resultados similares tanto nos níveis de expressão (Log2 fold change) quanto nos perfis de modulação. Essa idéia é corroborada pela análise de correlação de Pearson (Pearson correlation), em que os dois conjuntos de dados (RNA-seq e qPCR) apresentaram correlação fortemente positiva, com valores de R2 variando entre 0,8057 e 0,9868 (Figura 48). Assim, pode-se afirmar que o perfil de regulação dos genes identificados como responsivos aos estresses isolados e combinados de salinidade e temperatura elevada oriundo dos estudos de RNA-seq é altamente confiável.

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Figura 48. Análise de correlação do perfil de expressão dos genes CRT1(A), CAT1(B), DEAD-box(C), HSP23.6-MITO(D), MKK2(E),

MDHAR(F), PYL4(G), RBCS1A(H), WRKY60(I) e bZIP(J) via PCR em tempo real (qPCR, azul) e sequenciamento de RNA (RNA-seq, laranja). Os valores representam o nível de regulação dos genes nas folhas de plantas de sorgo, genótipos CSF20 e CSF18, frente aos estresses isolados e combinados (COMB) de salinidade (SAL) e temperatura elevada (TE). As comparações estão apresentadas da seguinte forma: 1 (CONT × SAL), 2 (CONT × TE), 3 (CONT × COMB), 4 (SAL × COMB), 5 (TE × COMB), 6 (SAL20 × SAL18), 7 (TE20 × TE18) e 8 (COMB20 × COMB18). Nas comparações indicadas pelos números 4 e 5, valores de Log2FC positivos indicam maior expressão no estresse combinado, ao

passo que valores negativos indicam modulação positiva nos estresses salino e por temperatura elevada, respectivamente. Já nas comparações representadas pelos números 6, 7 e 8, valores de Log2 FC positivos representam maiores valores de expressão em plantas do

genótipo CSF18, ao passo que Log2 FC negativo denota maior expressão nas plantas CSF20. Lacunas indicam que o gene não foi

diferencialmente expresso dentro da comparação. Em todos os tratamentos e comparações (exemplo: CONT × SAL) os dados de qPCR (azul) apresentaram diferença estatística (p-value<0,05).

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8DISCUSSÃO

No presente estudo, dois genótipos de sorgo com tolerância diferencial à salinidade, CSF20 (tolerante) e CSF18 (sensível)(LACERDA et al., 2003; COSTA et

al., 2005), foram submetidos aos estresses isolados e combinados de salinidade e

temperatura elevada com o intuito de elucidar mecanismos de tolerância aos estresses abióticos. Os resultados demonstraram que as respostas das plantas de sorgo são bastante complexas e envolvem intricadas vias de sinalização, as quais são dependentes do genótipo e do tipo de estresse.

8.1 Vias de sinalização e mecanismos de tolerância de plantas de sorgo ao