SPERM HAZIRLANMASI

İntrauterin inseminasyon düşük sperm sayısı, zayıf motilite, zayıf penetrasyon yeteneği ve servikal immunite bozukluklarında daha fazla motil spermin fertilizasyon sahasına ulaşmasını sağlar. IUI, seminal plazma içerisindeki prostaglandinlerin şiddetli uterin kasılmalara neden olması ve olası bakteriyel kontaminasyon dolayısıyla uygun hazırlama yöntemleri kullanılıp seminal plazmadan arındırılmış, hareketli spermlerle yapılmalıdır. İnseminasyon için kullanılacak miktarın 0.5 cc’ yi geçmesinin de uterusta kontraksiyonlara yol açabileceği ve ağrılı olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. IUI uygulaması ile ilgili çoğu yayında hasta populasyonu çok heterojendir (83-85) ve az sayıda hastaya dayalı olarak sonuclar verilmektedir. Bircok araştırmacı erkek faktörü olan infertilitede düşük başarı oranları yayınlamışlardır. Bu düşük oran oligosperminin derecesiyle orantılıdır. Hamilelikle sonuçlanan en düşük total sperm sayısı 1 ile 5 milyon/ml arasında değişmektedir. Son yıllarda total motil sperm sayısının IUI sonuçlarını etkilediği bir kaç yayında belirtilmektedir (86-93). IUI da başarı oranları sperm parametrelerindeki defekt veya defektlerin sayısı ve ciddiyetiyle doğru orantılıdır. Bu amaçla kullanılacak kriterler arasında en önemli yeri strict kriterler ile değerlendirilmiş sperm morfolojisi (MEUSC) almakta olup IUI icin limit >%4 normal morfolojidir.

Sperm değerlendirilmesi

Sperm örneği genellikle inseminasyon zamanından yaklaşık 2 saat önce yapılır. Sperm steril, tek kullanımlık, plastik, toksik olmayan kapaklı bir kaba toplanır. Kabın üzerine daha önceden kocanın adı ve kadının adı su ile çıkmayan bir cam kalemi ile yazılmış olmalıdır.

Daha önceden yüksek viskozitesi olduğu bilinen örnekler için kabın içine 1 ml yıkama solüsyonu konulur. Daha önceden sperm antikorlarının varlığı biliniyorsa, örnek % 50 serum albumini içeren bir medyum içine konulmalıdır, ve bu örnekler hızlıca yoğunluk katmanlı bir yıkama ortamı içine konulmalıdır.

Likefaksiyon yaklaşık 30 dakika içinde tamamlanmalıdır. Analiz öncesinde örnek iyice karıştırılır, rengi, kıvamı kaydedilir. Kıvamlı ( visköz ) örnekler pipet içine kolay gelmez ve yapışkan lifler bırakır. Yüksek kıvamlılık motilite ve yoğunluğun doğru tayinini engeller, ve pipet veya iğne ile tekrarlanan aspirasyon viskositeyi azaltabilir. Daha sonra hemositemetre veya tercihan Makler odacığında sperm sayımı yapılır. Makler odacığının özelliği sayının yanında hareketliliğin de aynı anda değerlendirilmesidir. Örnek 20x büyütme mikroskop altında yapılır. Yabancı hücreler ( lökosit vb ) sayılır. Aglütinasyon varsa tipi belirtilir ( baş-baş, kuyruk-kuyruk, baş-kuyruk ). Sperm parametrelerinin değerlendirilmesinde Dünya

Sağlık Örgütü ‘ nün ( WHO ) kriterleri kullanılmalıdır (94).Sperm yoğunluğu için 10 karedeki sperm sayılır, toplam sayı 1x1milyon / ml ile çarpılır ve sperm yoğunluğu elde edilir. Eğer sperm yoğunluğu 10 milyon / ml ‘ den az ise, bütün 100 kare sayılmalıdır.

Hareketlilik için 20 kare içindeki hareketli sperm sayılır ve bu 20 kare içindeki toplam sperm sayısına bölünür ve 100 ile çarpılarak, yüzdesi bulunur. İleri hareketlilik ise 1‘ den 4‘ e ( D-A ) kadar ölçeklendirilir.

1( D ):hareketsiz sperm

2( C ):öne doğru ilerlemeyen hareketli sperm 3( B ):öne doğru yavaş ilerleyen hareketli sperm

4( A ):öne doğru hızlı ve düzenli ilerleyen hareketli sperm

Normal fertil bir semen örneği yüksek oranda morfolojisi anormal sperm içerir; ancak sperm morfolojisi hala tam anlaşılamamıştır. Her ne kadar anormal morfoloji olan spermin fertilizasyon yeteneği azalmış olsa da, morfolojik ile ilişkili gerçek anormallikler tam olarak tanımlanamamıştır. Detaylı morfoloji sayımı boyalı bir salyt üzerinde Dünya Sağlık Örgütü el kitabında tanımlandığı gibi yapılmalıdır. Bir damla sperm 0.01 mol / L fosfat tamponu içindeki % 1 formaldehit damlacığı ile karıştırılmalı ve önce distile su içindeki % 1 eosin, sonra da distile su içindeki % 10 nigrosin ile boyanmalıdır. Normal bir baş, baş/genişlik oranı : 1.50 / 1.75 ve oval olmalıdır. Akrozom bölgesi başın % 40-70‘ ini kaplamalı ve belirgin olmalıdır. Boyun, ortaparça veya kuyruk anormallikleri olmamalı ve sitoplazmik damlacıklar normal bir sperm başının 1/3‘ ünden daha fazla bir hacim kaplamamalıdır. Bütün sınırdaki spermler anormal olarak kabul edilmelidir.

IUI için sperm hazırlanması

Sperm hazırlanma tekniği seçimi veya tekniklerin bir arada kullanılması hareketli sperm sayısı, hareketli/hareketsiz sayım oranı, hacim ve antikor, pü hücreleri ve debris varlığına göre yapılır. Bütün işlemler boyunca steril olunmalıdır. Ejakulat spermatazoa içeren, testiküler ve epididimal salgılarla ejekulasyon anında prostat salgılarıyla karışmış bir sıvıdır.

Seminal plazma kapasitasyonu engelleyen ve fertilizasyonu önleyen maddeler içerir. Sperm hazırlanmasının amacı motil spermatazoaları yoğunlaştırıp semina plazma ve diğer hücrelerden ayırmaktır. Semen içindeki lökosit ve ölü sperm reaktif oksijen türlerinin kaynağı olup, bunlar sperm membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Böylece membran sıvı akışkanlığı kaybolur ve fertilizasyon sırasında sperm füzyon olaylarını engeller(95, 96).

Basit yüzeye yatırma ve swim-up ( yüzdürme ) tekniği orta-yüksek sayılı ( >35 milyon sperm / ml ) örneklerde yeterli iyi öne doğru hareketli sperm elde edilebilir. Devamsız yoğunluk

katmanlı ( discontinous density gradient ) santrifügasyonu aşağıdaki durumlarda kullanılmalıdır: düşük motilite, zayıf öne doğru hareketlilik, yüksek oranda debris ve / veya hücre varlığı, antisperm antikorları varlığı. Her işlemin sonunda ph %5 CO2 varlığında dengelenmelidir.

Sperm yıkama

Sperm yıkamanın en basit yöntemi likefiye olmuş semen örneğini tamponlu ( ticari olarak rahatlıkla bulunabilen ) bir medyum içeren steril tüp içinde ( 1/1 – 1/3 hacimsel oranda ) seyreltmektir. Daha sonra düşük santrifügasyona ( 200g/10 dakika ) tabii tutulur ve süpernatant atılır. İki veya daha fazla siklus sonrasında son pellet küçük hacimde ( 0.5 ml ) seyreltilir. Sperm yıkama ile oldukça yüksek sayıda sperm elde edilir ancak, son solüsyon ayrıca ölü ve anormal sperm ile diğer hücresel atıkları içerebilir.

Standart swim-up veya yüzeye yatırma

Semen örneği 1 ml‘ lik alikotlar halinde 1 ml Earle‘ s balanced salt solution ( EBSS ) medyumu altına yatırılır ve 30 dakika % 5 CO2 ve 37˚C ‘ de bekletilir. Daha sonra sıvını üstü bir Pastör pipeti ile nazikçe aspire edilir ve 4 ml medyum ile 10 dakika x200g santrifügasyon ile yıkanır. Pellet 0.3-0.5 ml ile dilüe edilir. Bu yöntemle temiz, ölü ve diğer hücresel artıklardan arınmış sperm elde edilir. Ancak sperm sayısı da azalır. Bundan dolayı sperm yoğunluğu çok düşük olduğunda önerilmez.

Yoğunluk katmanlı santrifügasyon

Genellikle ticari olarak bulunan Percoll veya benzeri partikül içeren yoğun solüsyonlar % 90 ,

%45 olarak human tubal fluid veya HBSS ile hazırlanır. Bu solüsyonlar PureSperm ( Nicadon , İsveç ), sperm Preparation Medium ( Medi-Cult, Danimarka ), Isolate ( Irvine ,

ABD ), Sperm Grad-Sperm Rinse ( Vitrolife , İsveç ) ticari isimlerinde hazır olarak pazarlanmaktadır. En yoğun solüsyon en alta konulur ve semen en üste nazikçe konulur ve 15-30 dakika 200g santrifüge edilir. En hızlı hareketli sperm bu yoğunluk katmanlarını en hızlı olarak geçer ve tüpün dibindeki yumuşak pellet içinde toplanır. Bu yöntem ayrıca normal morfolojili olan popülasyonu da seçer. Yukarı yüzdürme yöntemi gibi bu yöntemle az ama oldukça motil sperm elde edilir (97). Sperm sayısı çok az olduğunda sadece % 90‘ lık yoğunluk kullanılabilir. IUI için 5 çeşit sperm hazırlama tekniğinin karşılaştırıldığı randomize kontrollü bir çalışmada yukarı yüzdürme ve Percoll katmanlı hazırlamaların, sadece yıkama, aşağı yüzdürme ve soğutup heparin ile yıkamaya göre anlamlı olarak gebelik oranını artırdığı gösterilmiştir (98).