4.10.1. Adsorção em carvão ativado
Foi adicionado carvão vegetal ativado em pó ao extrato enzimático bruto nas seguintes concentrações de carvão: 1%, 5%, 10% e 20%, a fim de promover adsorção física da enzima ao carvão. O processo foi realizado sob agitação de 160 rpm, a 4°C, por 45 minutos. O carvão com a enzima adsorvida foi filtrado, seco e utilizado na reação enzimática. O filtrado obtido foi também analisado.
4.10.2. Adsorção em Bagaço de cana
O extrato concentrado foi imobilizado em bagaço de cana de açúcar baseado no protocolo de Coelho (2007) com modificações. O bagaço de cana de açúcar, doado pela Usina do Grupo COSAN, Tarumã - SP, foi lavado, seco em estufa à 65ºC por 48 h e triturado de forma a obter partículas de bagaço entre 1,00 e 1,19 mm. Quantidades de 1 g de bagaço foram adicionados em frascos Erlenmeyers de 250 mL e submetidos ao tratamento com Polietilenoimina (PEI).
Para o tratamento, 50 mL de solução de PEI 2% (v/v), pH 7,00, foi adicionada aos frascos contendo bagaço de cana. Os frascos permaneceram sob agitação a 160 rpm durante 24 h e, a seguir, foram autoclavados por 20 minutos, lavado com água e seco em estufa à 65ºC por 48 h.
Em seguida, 5 mL de extrato concentrado foi adicionado a 0,25 g de bagaço tratado. A mistura ficou sob agitação de 160 rpm por 1 h, em banho de gelo. Posteriormente o bagaço foi filtrado, lavado com água e analisado quanto à atividade enzimática.
4.10.3. Imobilização por troca iônica em resina Amberlite™ MB20 O extrato concentrado foi imobilizado em resina Amberlite™ MB20 previamente tratada com PEI e glutaradeído. Inicialmente, 1 g de Amberlite foi adicionado à 5 mL de ativador 2,5% (v/v) (PEI ou glutaraldeído), a mistura
permaneceu sob agitação de 160 rpm por 24 h. Após o tratamento, 1 g de resina tratada foi misturada a 2,5 mL de extrato concentrado, permanecendo sob agitação suave por 1 h, em banho de gelo. Em seguida, a Amberlite foi filtrada, lavada com 5 mL de água e analisada quanto à Atividade Enzimática e teor de açúcar produzido.
4.10.4. Imobilização em quitosana como agente de cross-linking O extrato concentrado foi imobilizado segundo o protocolo de Arsenault, Cabana e Jones (2011) com modificações. Quitosana (alto peso molecular) foi solubilizada em HCl 0,1 mol.L-1 para uma concentração final de 5 g.L-1. A seguir, 10 mL dessa solução foi adicionada a 0,1917 g de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodi-imida (EDAC) e 5 mL de extrato concentrado. Essa mistura ficou sob agitação suave por 48 h, a 4°C. Então o pH foi corrigido para 6,00 com NaOH 2 mol.L-1 e a solução permaneceu em repouso por 12 h, a 4°C e, em seguida, foi centrifugada por 20 minutos a 3000 rpm. A enzima precipitada após a centrifugação foi lavada com 5 mL de tampão acetato 0,2 mol.L-1, pH 5,6, e analisada quanto à atividade enzimática.
4.10.5. Imobilização em alginato e quitosana: Peletes a) Alginato
Foi preparado 3 mL de uma solução de alginato de sódio 3% (m/v) em extrato enzimático concentrado. A mistura foi gotejada em solução de cloreto de cálcio 0,15 mol.L-1 para a formação dos peletes. Após repouso inicial de 24 h, a 4°C, os peletes foram filtrados, lavados com água deionizada por 1 h, filtrados novamente e então analisados quanto à atividade enzimática. No grupo controle foi utilizado de água deionizada no lugar do extrato.
b) Alginato e glutaraldeído
Os peletes foram preparados como descrito em 4.10.5 (a), passando por uma lavagem com glutaraldeído 0,5% (v/v) por 1 h, após as 24 h de repouso inicial.
c) Quitosana
Foi preparado uma solução de quitosana (alto peso molecular) em ácido acético 1% (v/v) e adicionada ao extrato enzimático concentrado para uma
concentração final de 2% (m/v) de quitosana e volume de 3 mL. A mistura foi gotejada em solução de tripolifosfato de sódio (TPP) 5% (m/v). Após 24 h de repouso inicial, a 4°C, os peletes foram filtrados, lavados com água deionizada por 1 h, filtrados novamente e então analisados quanto à atividade enzimática. No grupo controle foi utilizado de água deionizada no lugar do extrato.
d) Quitosana e glutaraldeído
Os peletes foram preparados como descrito em 4.10.5 (c), passando por uma lavagem com glutaraldeído 0,5% (v/v) por 1 h, após as 24 h de repouso inicial.
4.10.6. Imobilização em alginato e quitosana: Biofilme
a) Alginato
Uma solução de 2,5 mL de alginato de sódio 6% (m/v) foi adicionada a 2,5 mL extrato concentrado para uma concentração final de 3% (m/v) de alginato. A mistura foi colocada em placas de Petri de 90 mm de diâmetro. Uma parte das placas foi seca em estufa a 30°C por 4 h, e o restante não passou pelo procedimento de secagem. Na próxima etapa, os dois grupos de placas receberam 10 mL de CaCl2 0,15 mol.L-1 para a formação do biofilme. Após repouso por 24 h, a 4°C, os biofilmes foram filtrados, e então analisados quanto à atividade enzimática e teor de açúcar produzido. No grupo controle foi utilizado água deionizada no lugar do extrato (OLIVA-NETO e MENÃO, 2009).
b) Alginato e glutaraldeído
Os biofilmes foram preparados como descrito em 4.10.6 (a), passando por uma lavagem com glutaraldeído 0,5% (v/v) por 1 h, após as 24 h de repouso inicial.
c) Alginato e PEI
Os biofilmes foram preparados como descrito em 4.10.6 (a), passando por uma lavagem com PEI 0,5% (v/v) por 1 h, após as 24 h de repouso inicial.
d) Quitosana
Uma solução de 2,5 mL de quitosana 4% (m/v) (alto peso molecular) preparada em ácido acético 1% (v/v) foi adicionada ao extrato enzimático para uma
concentração final de 2% (m/v) de quitosana. A mistura foi colocada em placas de Petri de 90 mm de diâmetro. Uma parte das placas foi seca em estufa a 30°C por 4 h, e o restante não passou pelo procedimento de secagem. Na próxima etapa, os dois grupos de placas receberam 10 mL de TPP 5% (m/v) para a formação do biofilme. Após repouso por 24 h, a 4°C, os biofilmes foram filtrados, lavados com água e então analisados quanto à atividade enzimática e teor de açúcar produzido. No grupo controle foi utilizado de água deionizada no lugar do extrato.
e) Quitosana e glutaraldeído
Os biofilmes foram preparados como descrito em 4.10.6 (d), passando por uma lavagem com glutaraldeído 0,5% (v/v) por 1 h, após as 24 h de repouso inicial.
f) Quitosana e PEI
Os biofilmes foram preparados como descrito em 4.10.6 (d), passando por uma lavagem com PEI 0,5% (v/v) por 1 h, após as 24 h de repouso inicial.
4.11. Imobilização da biomassa