Bu çalışmada, ekmeklerde meydana gelen başlıca bozulmalardan olan sünme hastalığının, dört farklı sıcaklık derecesindeki (4, 25, 37 ve 45ºC) gelişimi, normal ve kepekli ekmeklerde ayrı ayrı olmak üzere fiziksel, kimyasal, tekstürel ve mikrobiyolojik değişimlere bağlı olarak incelenmiş; ekmeklerden izole edilen Bacillus türleri hem klasik yöntemlerle hem de API test kitleri ile tanılanmıştır. Çalışmada kullanılan sıcaklıkların seçilme nedeni; 4ºC’nin soğukta depolama koşullarını, 25ºC’nin oda koşullarını, 45ºC’nin yaz aylarında Antalya bölgesinde bulunan ekmek satış ortamlarını temsil etmesi, 37ºC’nin ise Bacillus türlerinin optimum geliştiği sıcaklık derecesi olmasıdır. Tanılamanın iki farklı yöntemle yapılma nedeni ise karşılaştırma yapma imkanı sağlayarak en doğru sonuca hangi yöntemle ulaşılabileceğini belirlemektir.
Ekmeklerde bulunan sünme etmeni Bacillus türlerinin kaynağı temelde ekmek hammaddeleridir. Bu nedenle tüm hammaddelerde sünme sporu sayımı yapılmış ve spor yükü en yüksek olan kaynağın maya (93EMS/g) olduğu, bunu sırasıyla kepekli un (43EMS/g), normal un (23EMS/g), su (4.3EMS/g), şeker (3.6EMS/g) ve tuzun (<3EMS/g) izlediği saptanmıştır.
Yapılan istatistiksel analizler, sünme gelişiminin takibi için değişimi izlenen tüm mikrobiyolojik, kimyasal ve tekstürel özelliklerin sıcaklık derecesine önemli düzeyde (p<0.01) bağımlı olduğunu göstermiştir. TMAB sayımı dışındaki tüm özelliklerin ekmek tipinden de önemli düzeyde (p<0.01) etkilendiği saptanmıştır.
Araştırma sonuçları, katkı maddesi kullanmaksızın gerçekleştirilen ekmek üretiminde sünme hastalığının yalnızca 4ºC’de muhafaza edilen ekmeklerde oluşmadığını, diğer sıcaklıklarda, sıcaklık derecesine bağlı olmakla birlikte farklı sürelerde hastalığın oluştuğunu göstermiştir. 4ºC’de sünme gelişimi gözlenmemiştir ancak bu sıcaklıkta da ekmek bayatlamasının hızlı olması olumsuz bir özellik olarak göze çarpmaktadır.
Ekmeklerde sünme hastalığı kötü koku oluşumu ile başlamış, görsel olarak hastalığın hissedilir hale gelmesi biraz daha fazla zaman almıştır. Bu bağlamda 25ºC’de her iki ekmek tipi için de 2. günde kokudaki değişim fark edilir düzeye ulaşırken, ekmeklerde hastalığın gözlendiği noktalardaki kahverengileşme ve sıvılaşma normal ekmekte 3. ve 4. gün arasında, kepekli ekmekte ise 4. günde gerçekleşmiştir. 37ºC ve 45ºC’de normal ekmekte koku oluşumu 1. gün içinde kendini gösterirken, görsel olarak 37ºC’de 3. günde, 45ºC’de 2. günde oluşmuştur. Kepekli ekmeklerde ise hastalığın daha kısa sürede oluştuğu tespit edilmiştir. 37ºC’de koku değişimi bir günden daha kısa sürede, görüntüdeki değişim ise 1. günde; 45ºC’de ise 1. günde koku değişimi, 2. günde ise görsel değişim gerçekleşmiştir.
Ekmeklerden izole edilen Bacillus türlerinin tanılanmasında hem klasik yöntemler hem de API test kitleri ile benzer sonuçlar elde edilen izolatlar olsa da genel olarak bakıldığında iki yöntemle ulaşılan sonuçlar arasında farklılıklar vardır. Bu durumun en önemli nedeni heterojen özelliklere sahip Bacillus türlerinin klasik yöntemlerle tanısının zor olmasıdır. Nitekim yapılan biyokimyasal testlerde pozitif sonucun kontrolü için bazı testlerde inkübasyon süresinin 14 güne kadar uzatılması, tanılama işleminin hassasiyetini azaltmaktadır.
Normal ekmekte biyokimyasal testlerle B. subtilis (%50), B. megaterium (%22.73), B. licheniformis (%13.64), B. coagulans (%9.09) ve B. pumilus (%4.55) olarak tanılanan izolatlar, API test kitleri ile B. licheniformis (%22.73), B. pumilus (%13.64), B. subtilis/amyloliquefaciens (%4.55), muhtemelen B. megaterium (%4.55) ve kabul edilemez profil (%54.55) olarak tanılanmıştır. Kepekli ekmekte ise biyokimyasal tanılama sonuçları B. subtilis (%36.8), B. megaterium (%31.58), B. licheniformis (%21.05) ve tanılanamayan (%10.53) şeklindeyken, API test kitleri ile tanılama sonuçları B. licheniformis (%21.05), muhtemelen B. megaterium (%15.79), Bacillus spp. (%10.53), B. subtilis/amyloliquefaciens (%5.26), muhtemelen B. thuringiensis (%5.26) ve kabul edilemez profil (%42.11) şeklindedir.
Yapılan çalışmalar B. subtilis ile oldukça yakın ilişkili türler bulunduğunu; eskiden B. subtilis olarak tanılanan pek çok türün B. atropheus, B. mojavensis ve B. vallismortis
olduğunun belirlendiğini; B. subtilis’in B. subtilis subsp. subtilis ve B. subtilis subsp. spizizenii olmak üzere iki alt gruba ayrıldığını göstermiştir (Nakamura vd 1989, Roberts vd 1994, Roberts vd 1996, Reva vd 2004). Bu türlerin biyokimyasal testlerle ayırt edilemediği gibi API veri tabanında da yer almaması, yapılan tanılamanın güvenilirliğini tehlikeye atmaktadır. Dolayısıyla bu tez çalışması ile sadece biyokimyasal testlerle değil, API test kitleri ile de yeterince doğru sonuç elde edilemeyebileceği görülmüştür. Nitekim bu sonuç daha önce yapılmış çalışmalarda da bildirilmiş, moleküler tekniklerle yapılacak tanılamanın gerçeği daha iyi yansıtacağı öne sürülmüştür (Thompson vd 1993, Fritze 2002).
Ekmeklerde sünme, ekmek yapısında meydana getirdiği değişimler itibariyle pek çok kaynakta tarifi yapılan bir oluşumdur. Bu çalışma ile sünme hastalığı sonucu ekmeklerin yapısal özelliklerinde (sertlik, adezif ve kohezif yapışkanlık, zamksılık, çiğnenebilirlik, elastikiyet, esneklik) meydana gelen yapısal değişimler ilk kez incelenmiş olup bilim çevrelerince kullanılabilir bilimsel sayısal değerler ve uygulama esasları elde edilmiştir. Bu çalışma sünme gelişen ekmeklerde tekstür analizlerinin de sünme hızının tahmininde kullanılabileceğini göstermiştir.
Sünme hastalığının matematiksel olarak modellenmesinde hem tekstürel hem de kimyasal özelliklerdeki değişimlerin kullanılabileceği ancak kinetik parametrelerin bilinen lineer regresyon analizi ile belirlenmesinin pek mümkün olmadığı görülmüştür. Ancak 0., 1. ya da 2. dereceden reaksiyonlara en iyi uyum sağlayan özellikler (sertlik değişimi ve serbest amino asit oluşumu) baz alınarak 25ºC, 37ºC ve 45ºC’de gerçekleşen reaksiyonlar için hesaplanan hız sabitlerine göre sıcaklık arttıkça reaksiyon hızının da azalan bir hızla arttığı tespit edilmiştir. Sünme ile birlikte ekmek içinde meydana gelen değişimlerin sıcaklığa bağımlılığının yüksek olduğu, sertlik değişimi için 27416.25j/mol, ve serbest amino asit oluşumu için 72513.05j/mol olarak hesaplanan aktivasyon enerjisi değerlerinden anlaşılmaktadır. Serbest amino asit oluşumu için belirlenen aktivasyon enerjisi değerinin daha da yüksek olması bu parametrenin sıcaklık değişimlerinden daha fazla etkilendiğini göstermektedir.
Bugüne kadar genellikle enzim üretme amaçlı veya biyoteknolojik amaçlar için kullanılan Bacillus’lar, topraktan veya tuzlu, sodalı ve benzer değişik su ortamlarından izole edilmiştir. Oysa bu çalışmada ekmeklerden izole edilerek, fırında 100°C’ye yakın sıcaklıklarda spor oluşturarak canlı kalabilen sünme etmeni bakteriler arasından enzim aktivitesine sahip olanları seçilerek sanayinin birçok alanında ihtiyaç duyulan enzimleri üretmenin mümkün olabileceğinin ihtimal dahilinde olduğu görülmüştür. Nitekim sanayinin birçok alanında, büyük ölçekli enzim üretiminde Bacillus subtilis ve Bacillus licheniformis’ten önemli ölçüde yararlanıldığı bilinmektedir.
Ekmeklerde sünme etmeni bakterilerin biyokimyasal testler ve API kitleriyle tam olarak tanılanamayacağı, moleküler tekniklerle daha sağlıklı tanılamaların yapılabileceği, sünme sonucu oluşan yapıya ve kimyasal değişimlere göre sünmenin hızının ve değişim seyrinin matematiksel fonksiyonlarla tahmin edilebileceği, elde edilen izolatların enzim üretme özellikleri ve bu ürettikleri enzimlerin karakterize edilmelerinin, ileride bu yönde çalışmaların sürdürülmesinin gerektiği söylenebilir.