sonra ABS uygulaması

52

oranı %37 ve 19.1 μM konsantrasyonda 5-FU’nun hücre canlılık oranı %46 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %7.7 olarak saptandı. 4 LD50’ye denk gelen 108 μl

ABS’nin hücre canlılık oranı %20 ve 38.26 μM konsantrasyonda 5-FU’nun hücre canlılık oranı %41 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %23.5 olarak saptandı. Saptanan sitotoksisite yüzdeleri, CompuSyn programına girilerek kombinasyonların CI değerleri hesaplandı (Tablo 20).

Tablo 20. Önce 5-FU ve sonra ABS uygulamasının CI değerleri

İlaç Konsantrasyonları CI Yorum

1/8 LD50: ABS (3.38 µl) + 5-FU (1.2 µM) 0.006 Çok kuvvetli sinerjizm

1/4 LD50: ABS (6.75 µl) + 5-FU (2.4 µM) 0.004 Çok kuvvetli sinerjizm

1/2 LD50: ABS (13.5 µl) + 5-FU (4.8 µM) 0.009 Çok kuvvetli sinerjizm

LD50: ABS (27 µl) + 5-FU (9.6 µM) 0.015 Çok kuvvetli sinerjizm

2 LD50: ABS (54 µl) + 5-FU (19.13 µM) 0.039 Çok kuvvetli sinerjizm

4 LD50: ABS (108 µl) + 5-FU (38.26 µM) 0.775 Hafif sinerjistik etki

Önce Oxaliplatin sonra ABS uygulaması: Daha önceki çalışmalarda LD50 değerleri

belirlenen Oxaliplatin ve ABS’nin, bire bir olarak 4, 2, 1, 1/2, 1/4, 1/8 LD50 konsantrasyonları

kombine edildi.

HT-29 hücre serisine aynı anda uygulanan ABS ve Oxaliplatin kombinasyonları, 72 saat inkübasyon sonrasında hücre canlılığını istatiksel olarak anlamlı seviyede düşürdü (p<0.0001). Şekil 25’e bakıldığında 1/8 LD50’ye denk gelen 3.38 μl ABS’nin hücre canlılık oranı %68 ve

0.125 μg/ml konsantrasyonda Oxaliplatin’in hücre canlılık oranı %76 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %16 olarak saptandı. 1/4 LD50’ye denk gelen 6.75 μl

ABS’nin hücre canlılık oranı %65 ve 0.25 μg/ml konsantrasyonda Oxaliplatin’in hücre canlılık oranı %68 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %8.8 olarak saptandı. 1/2 LD50’ye denk gelen 13.5 μl ABS’nin hücre canlılık oranı %58 ve 0.5μg/ml konsantrasyonda

Oxaliplatin’in hücre canlılık oranı %69 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %9.6 olarak saptandı. LD50’ye denk gelen 27 μl ABS’nin hücre canlılık oranı %53 ve 1

μg/ml konsantrasyonda Oxaliplatin’in hücre canlılık oranı %57 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %10.7 olarak saptandı. 2 LD50’ye denk gelen 54 μl

53

ABS’nin hücre canlılık oranı %37 ve 2 μg/ml konsantrasyondan Oxaliplatin’in hücre canlılık oranı %53 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı % 18 olarak saptandı. 4 LD50’ye denk gelen 108 μl ABS’nin hücre canlılık oranı %20 ve 4 μg/ml konsantrasyonda

Oxaliplatin’in hücre canlılık oranı %46 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %24 olarak saptandı. Saptanan sitotoksisite yüzdeleri, CompuSyn programına girilerek kombinasyonların CI değerleri hesaplandı (Tablo 21).

Şekil 25. HT-29 hücre hattında önce Oxaliplatin sonra ABS’nin uygulamasının hücre canlılığına etkisi (± standart hata *p<0.0001 kontrole göre)

Tablo 21. Önce Oxaliplatin ve sonra ABS uygulamasının CI değerleri

İlaç Konsantrasyonları CI Yorum

1/8 LD50: ABS (3.38 µl) + Oxaliplatin (0.125 μg/ml) 0.011 Çok kuvvetli sinerjizm

1/4 LD50: ABS (6.75 µl) + Oxaliplatin (0.25 μg/ml) 0.006 Çok kuvvetli sinerjizm

1/2 LD50: ABS (13.5 µl) + Oxaliplatin (0.5 μg/ml) 0.015 Çok kuvvetli sinerjizm

LD50: ABS (27 µl) + Oxaliplatin (1μg/ml) 0.039 Çok kuvvetli sinerjizm

2 LD50: ABS (54 µl) + Oxaliplatin (2μg/ml) 0.230 Kuvvetli sinerjizm

4 LD50: ABS (108 µl) + Oxaliplatin (4μg/ml) 0.846 Hafif sinerjistik etki

* * * * * * * * * * * * * * * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Kontrol 1/8 LD50 1/4 LD50 1/2 LD50 1 LD50 2 LD50 4 LD50 % C an lıl ık

Önce Oxaliplatin sonra ABS uygulaması

54

Önce Cetuximab sonra ABS uygulaması: Daha önceki çalışmalarda LD50 değerleri

belirlenen Cetuximab ve ABS’nin, bire bir olarak 4, 2, 1, 1/2, 1/4, 1/8 LD50 konsantrasyonları

kombine edildi. HT-29 hücre serisine aynı anda uygulanan ABS ve Cetuximab kombinasyonları, 72 saat inkübasyon sonrasında hücre canlılığını istatiksel olarak anlamlı seviyede düşürdü (p<0.0001).

Şekil 26 incelendiğinde; 1/8 LD50’ye denk gelen 3.38 μl ABS’nin hücre canlılık oranı

%68 ve 0.07 μg/ml konsantrasyonda Cetuximab’ın hücre canlılık oranı %59 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %9 olarak saptandı. 1/4 LD50’ye denk gelen 6.75

μl ABS’nin hücre canlılık oranı %65 ve 0.14 μg/ml konsantrasyonda Cetuximab’ın hücre canlılık oranı %59 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %11.7 olarak saptandı. 1/2 LD50’ye denk gelen 13.5 μl ABS’nin hücre canlılık oranı %58 ve 0.29 μg/ml

konsantrasyonda Cetuximab’ın hücre canlılık oranı %51 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %11 olarak saptandı. LD50’ye denk gelen 27 μl ABS’nin hücre canlılık

oranı %53 ve 0.59 μg/ml konsantrasyonda Cetuximab’ın hücre canlılık oranı %49 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %10.5 olarak saptandı. 2 LD50’ye denk gelen 54

μl ABS’nin hücre canlılık oranı %37 ve 1.18 μg/ml konsantrasyonda Cetuximab’ın hücre canlılık oranı %43 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %10.8 olarak saptandı. 4 LD50’ye denk gelen 108 μl ABS’nin hücre canlılık oranı %20 ve 2.36 μg/ml

konsantrasyonda Cetuximab’ın hücre canlılık oranı %42 olurken, bu dozların kombinasyonu sonucu canlılık oranı %11 olarak saptandı.

Şekil 26. HT-29 hücre hattında önce Cetuximab sonra ABS uygulamasının hücre canlılığına etkisi (± standart hata *p<0.0001 kontrole göre)

* * * * * * * * * _* * * * _* * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Kontrol 1/8 LD50 1/4 LD50 1/2 LD50 LD50 2 LD50 4 LD50 Önce Cetuximab sonra ABS uygulaması

55

Değişik oranlarda kombinasyonların HT-29 hücre hattında 72 saat muamele edilmesi sonucu saptanan sitotoksisite yüzdeleri, CompuSyn programına girilerek kombinasyonların CI değerleri hesaplandı (Tablo 22).

Tablo 22. Önce Cetuximab ve sonra ABS uygulamasının CI değerleri

İlaç Konsantrasyonları CI Yorum

1/8 LD50: ABS (3.38 µl) + Cetuximab (0.07 μg/ml) 0.019 Çok kuvvetli sinerjizm

1/4 LD50: ABS (6.75 µl) + Cetuximab (0.14 μg/ml) 0.014 Çok kuvvetli sinerjizm

1/2 LD50: ABS (13.5 µl) + Cetuximab (0.29 μg/ml) 0.038 Çok kuvvetli sinerjizm

LD50: ABS (27 µl) + Cetuximab (0.59 μg/ml) 0.029 Çok kuvvetli sinerjizm

2 LD50: ABS (54 µl) + Cetuximab (1.18 μg/ml) 0.077 Çok kuvvetli sinerjizm

56

HT-29 Hücre Hattında Tek Olarak Uygulanan ABS, 5-FU, Oxaliplatin ve Cetuximab’ın Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi

HT-29 hücrelerinde kontrol ve madde uygulaması yapılan gruplarda belirlenen canlı, ölü ve apoptotik hücre yüzdeleri ile Anneksin V, PI floresan yoğunluğu ve hücre boyutu histogramları Şekil 27 ve Şekil 28’da verilmiştir.

Şekil 27. HT-29 hücre serisinde tali görüntü tabanlı sitometri kullanılarak saptanan canlı, ölü, apoptotik hücrelerin yüzdesi A:Kontrol, B:ABS, C:5-Florourasil,

57

Şekil 27A’da görüldüğü gibi, kontrol grubunda %92 oranında canlı, %7 ölü ve %1apoptotik hücre olduğu saptanmıştır.

Şekil 27B’de görüldüğü gibi, kontrol grubunda %1 olan apoptotik hücre oranının ABS uygulaması ile %22’ye yükseldiği, ölü hücre oranının ise %30 oranında olduğu saptanmıştır. Kontrol grubunda %92 olan canlılık oranının ABS uygulaması ile %48’e düştüğü saptanmıştır.

Şekil 27C’de görüldüğü gibi, kontrol grubunda %1 olan apoptotik hücre oranının 5-FU uygulaması ile %12’ye yükseldiği, ölü hücre oranının ise %22 oranında olduğu

saptanmıştır. Kontrol grubunda %92 olan canlılık oranının, 5-FU uygulaması ile %66’ya düştüğü saptanmıştır.

Şekil 27D’de görüldüğü gibi, kontrol grubunda %1 olan apoptotik hücre oranının Oxaliplatin uygulaması ile %10’ye yükseldiği, ölü hücre oranının ise %21 oranında olduğu saptanmıştır. Kontrol grubunda %92 olan canlılık oranının, Oxaliplatin uygulaması ile %69’a düştüğü saptanmıştır.

Şekil 27E’de görüldüğü gibi, kontrol grubunda %1 olan apoptotik hücre oranının Cetuximab uygulaması ile %12’ye yükseldiği, ölü hücre oranının ise %19 oranında olduğu saptanmıştır. Kontrol grubunda %92 olan canlılık oranının, Oxaliplatin uygulaması ile %69’a düştüğü saptanmıştır.

58

Şekil 28. HT-29 Hücre Hattında, madde uygulaması yapılan hücrelerin hücre boyutları, PI (Kırmızı) ve Annexin V (Yeşil) floresan yoğunlukları. A:Kontrol, B: ABS, C: 5-Florourasil Uygulaması

59

Şekil 28. (Devamı) HT-29 Hücre Hattında, madde uygulaması yapılan hücrelerin hücre boyutları, PI (Kırmızı) ve Annexin V (Yeşil) floresan

60

HT-29 Hücre Hattında ABS ile 5-Florourasil Kombinasyonlarının Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi

HT-29 hücrelerinde ABS’nin 5-FU ile aynı anda, önce ve sonra kombine uygulamasının yapıldığı gruplarda belirlenen canlı, ölü ve apoptotik hücre yüzdeleri ile Anneksin V, PI floresan yoğunluğu ve hücre boyutu histogramları Şekil 29 ve Şekil 30’da verilmiştir.

HT-29 hücrelerinde aynı anda ABS ve 5-FU uygulaması yapılan hücrelerde; canlı, ölü ve apoptotik hücre oranı sırası ile %44, %23,%33 olarak belirlenmiştir (Şekil 29A). Önce ABS sonra 5-FU uygulaması yapılan hücrelerde canlı, ölü ve apoptotik hücre oranı sırası ile %30, %26, %44 olarak belirlenmiştir(Şekil 29B). Önce 5-FU sonra ABS uygulaması yapılan hücrelerde canlı, ölü ve apoptotik hücre oranı sırası ile %63, %17, %20 olarak belirlenmiştir(Şekil 29C). ABS’nin 5-FU ile kombine tedavisinde, kontrol grubunda %92 olan canlılık oranının %30’a düştüğü ve yine kontrol grubunda %1 olan apoptotik hücre oranının %44’e çıktığı, önce ABS sonra 5-FU kombinasyonunun daha etkin sonuç verdiği saptanmıştır.

Şekil 29. HT-29 hücre serisinde tali görüntü tabanlı sitometri kullanılarak saptanan canlı, ölü, apoptotik hücrelerin yüzdesi A: Aynı anda 5-FU ve ABS, B:Önce ABS sonra 5-FU, C:Önce 5-FU sonra ABS

61