Ankaferd bloodstopper kanama durdurucunun in vitro kolon kanseri hücrelerinin çoğalmaları üzerine olan etkisi

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI

YÜKSEK LİSANS PROGRAMI

Prof. Dr. İlker DIBIRDIK

ANKAFERD BLOODSTOPPER KANAMA

DURDURUCUNUN İN VİTRO KOLON KANSERİ

HÜCRELERİNİN ÇOĞALMALARI ÜZERİNE OLAN

ETKİSİ

(Yüksek Lisans Tezi)

Büşra DİLER ZENGİNER

Referans no: 10102130

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI

YÜKSEK LİSANS PROGRAMI

Tez Yöneticisi Prof. Dr. İlker DIBIRDIK

ANKAFERD BLOODSTOPPER KANAMA

DURDURUCUNUN İN VİTRO KOLON KANSERİ

HÜCRELERİNİN ÇOĞALMALARI ÜZERİNE OLAN

ETKİSİ

(Yüksek Lisans Tezi)

Büşra DİLER ZENGİNER

Destekleyen Kurum: TÜBAP 2016/64

Tez no: EDİRNE-2017

TEŞEKKÜR

Akademik yaşamıma başladığım ilk günden bu güne, bilime bakış açısı ile kendisinden çok şey öğrendiğim çok değerli hocam Sayın Prof. Dr. İlker DIBIRDIK’a, Anabilim Dalı Başkanımız Sayın Prof. Dr. Erol ÇAKIR’a, değerli öğretim üyelerimiz Prof. Dr. Selma SÜER GÖKMEN, Prof. Dr. Sevgi ESKİOCAK, Prof. Dr. Hakan ERBAŞ, Yrd. Doç. Dr. Eray ÖZGÜN ve Öğr. Gör. Dr. Gülben SAYILAN ÖZGÜN’e, arkadaşlarım Aycan ÜNAL ve Araş. Gör. Çiğdem FİDAN’a, bu süreçte her zaman yanımda bulunan aileme, beni tanıdığı ilk günden bu yana her zaman beni destekleyen ve hep yanımda olan sevgili eşim Uğur ZENGİNER’e ve çalışmamızı destekleyen Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ

GENEL BİLGİLER

KOLON KANSERİ ... 3

KOLON KANSERİNİN MOLEKÜLER MEKANİZMASI ... 6

KOLON KANSERİNİN SINIFLANDIRILMASI ... 8

HÜCRE DÖNGÜSÜ ... 10

APOPTOZİS ... 11

DOĞAL ÜRÜNLERİN TEDAVİDE KULLANIMI ... 16

ANKAFERD BLOODSTOPPER ... 19

İLAÇLARIN KOMBİNE KULLANIMI ... 25

GEREÇ VE YÖNTEMLER

BULGULAR

TARTIŞMA

SONUÇLAR

ÖZET

SUMMARY

KAYNAKLAR

ŞEKİLLER LİSTESİ

ÖZGEÇMİŞ

SİMGE VE KISALTMALAR

5-FU : 5-Florourasil

ABS : Ankaferd Blood Stopper

Apaf-1 : Apoptotik proteaz aktive edici faktör-1 APC : Adenomatöz polipozis coli

Bax : Bcl-2 associated X protein Bcl-2 : B-Cell Lymphoma 2

cDNA : Komplementer deoksiribonükleik asit COX :Siklooksijenaz enzimi

CI : Kombinasyon İndeksi

DCC : Deleted in Colorectal Cancer FAP : Familyal adenomatöz polipozis DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Media EMEM : Eagle’s Minimum Essential Medium DMSO : Dimetil Sülfoksit

DNA : Deoksiribonükleik asit

DISC : Ölüm indükleyici sinyal kompleksi dTMP : Deoksitimidin monofosfat

dUMP : Deoksiuridin monofosfat Dvl : Dishelleved protein

EGFR : Epidermal Büyüme Faktör Reseptörü FADD : Fas ilişkili ölüm bölgesi

FBS : Fetal Sığır Serumu

FdUMP : 5-Floro deoksiüridin monofosfat

FOLFOX : Lökoverin + 5-Florourasil + Oxaliplatin kombinasyonu HNPCC : Herediter Non-Polipozis Kolorektal Kanser

HT-29 : İnsan kolon adenokarsinom hücre hattı

LD50 : Maksimum inhibisyonun %50'sini oluşturan ilaç konsantrasyonu MMR : Yanlış eşleşme tamir geni

MTT : 3-(4,5-Dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl tetrazolium Bromide PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu

TNFR-1 : Tümör Nekroz Faktör Reseptörü-1 TRADD : TNFR1-ilişkili ölüm bölgesi

1

GİRİŞ VE AMAÇ

Kolorektal kanserler, başta ABD olmak üzere, Avrupa ve diğer Batılı ülkelerde kanserle ilişkili morbidite ve mortalitenin en önemli sebeplerinden biridir (1). Dünyada ortalama yıllık 500.000 kişinin ölümüne neden olan kolorektal kanser, bütün kanser türleri içerisinde en sık görülen 3. kanser türüdür (2).

Kolon kanseri gelişimi, pek çok faktörle ilişkili olan çok basamaklı bir süreçtir (3). Tümör baskılayıcı genlerin aktivasyonlarındaki kayıplar, azalmış apoptozis ve aşırı hücre proliferasyonu, kolon kanseri gelişimine yol açan değişiklikler olarak kabul edilmektedir (4).

Kolon kanseri için öngörülen tedavi, cerrahi rezeksiyonu takiben uygulanan adjuvan kemoterapidir. Kemoterapide 5-Florourasil (5-FU), İrinotekan, Oxaliplatin ve Cetuximab kullanılmaktadır (2). Ancak belirli bir süre sonra meydana gelen ilaç dirençleri ve bu ilaçların yüksek dozlarda ciddi toksik etki oluşturması, araştırmacıları doğal kaynaklardan ilaç elde etmeye yöneltmiştir.

Standardize edilmiş bitki ekstraklarının karışımı olan ABS, klinikte hemostatik ajan olarak kullanılmaktadır. ABS’nin içeriğinde; Glycyrrhiza glabra (meyan), Alpinia officinarum (havlıcan), Thymus vulgaris (kekik), Vitis vinifera (koruk), Urtica dioica (ısırgan) bulunmaktadır. İçeriğinde bulunan bitkilerin; endotelyum, kan hücreleri, anjiogenez ve hücre proliferasyonu üzerine etkileri mevcuttur (5). Yapılan çeşitli çalışmalarda, ABS’nin kolon kanseri de dahil olmak üzere bir çok kanser türünde potansiyel bir anti-kanser ajan özelliği gösterdiği bildirilmiştir (6-8).

Bu çalışmada amaç; HT-29 insan kolon adenokarsinom hücre hattında ABS'nin kolon kanser hücreleri üzerindeki fonksiyonel etkisini incelemek ve ABS’nin konvansiyonel kemoterapötikler olan 5-FU, Oxaliplatin ve Cetuximab ile kombinasyonunun kolon kanseri

2

hücrelerindeki olası additif/sinerjik etkilerini ve apoptotik etkisini araştırmak ve bu etkiyi biyokimyasal apoptozis yolağının en önemli elemanlarından olan p53, bax, bcl-2, sitokrom c, apaf-1 ve kaspaz-3'ün gen ifade düzeyleri açısından değerlendirmektir.

Yaptığımız bu araştırmanın güncel tedavi yöntemlerine yeni ufuklar açabileceğini ve daha ileri çalışmalara temel olabileceğini düşünmekteyiz.

3

GENEL BİLGİLER

KOLON KANSERİ Kolonun Anatomisi

Ortalama uzunluğu 150 cm’yi bulan kalın bağırsak, ileum bitiminden anüse kadar uzanır. Kalın bağırsak; çekum, çıkan kolon, transvers kolon, inen kolon, sigmoid kolon ve rektumdan oluşmaktadır (Şekil 1) (9).

4

Kalın bağırsağı oluşturan bölümlerin uzunlukları şu şekildedir; kolonun ilk kısmını oluşturan çekumun uzunluğu 6 cm, genişliği ise 8 cm’dir. Çıkan kolon 15-20 cm, transvers kolon 50 cm, inen kolon 25 cm, sigmoid kolon ortalama 40 cm uzunluğundadır. Kalın bağırsağın son parçası olup anüsle son bulan rektum ise, ortalama 12 cm uzunluğundadır (9).

Kalın bağırsağın başlıca görevleri; emilim, salgılama, depolama, taşımadır (10). Kolon; su, klorür, sodyum, laktoz ve sakkaroz emilimi yapmakla birlikte, mikrofloral metabolizma ile alınan gıdaların yıkılması, semisolid maddelerin depo işlevini görmesi ve feçesi rektum ve anüse doğru ilerletmekle görevlidir (11).

Kolon Epidemiyolojisi

Kolon kanseri vakaları gün geçtikçe artış göstermektedir. Her yıl, dünya üzerinde 1 milyondan fazla insana kolon kanseri teşhisi konulmaktadır. İstatistiksel olarak bakıldığında, kolon kanserinin kanserler arasında görülme sıklığı açısından 3. sırada olduğu, kansere bağlı ölümler arasında ise 4. sırayı aldığı görülmektedir (12).

GLOBOCAN 2012 verilerine göre kolorektal kanser, Avustralya, Yeni Zelanda, Avrupa, Kuzey Amerika başta olmak üzere, tüm dünyada yaygın olarak görülmektedir (Şekil 2) (13).

5

Kolon kanseri, sanayileşmenin gelişmiş olduğu batılı ülkelerde hızlı bir artış göstermektedir. GLOBOCAN 2012 istatistiksel verilerine göre (13), kolon kanserinin Avrupa ve Amerika’da yaygın olduğu, Asya ve Afrika’da ise daha düşük insidansa sahip olduğu görülmektedir. 2016 yılı için, Amerika Birleşik Devletleri’nde 134.490 yeni kolon kanseri vakası teşhisi konulacağı ve 49.190 kişinin ise kolon kanserinden öleceği tahmin edilmektedir (14).

Ülkemizde ise kolorektal kanser, 2013 yılı T.C. Sağlık Bakanlığı Kanser Daire Başkanlığı verilerine göre, erkeklerde akciğer ve prostat kanseri, kadınlarda ise meme ve tiroit kanserinden sonra 3. sırada yer almaktadır. 2013 yılı Sağlık Bakanlığı kanser kayıt verilerine göre, tüm kanserler içerisindeki kolorektal kanser görülme oranı erkeklerde %9.1, kadınlarda ise %8.3 olduğu görülmektedir (Şekil 3,4) (15).

Şekil 3. Tüm yaş gruplarındaki erkeklerde en sık görülen bazı kanserlerin bu grup içindeki yüzde dağılımları (Türkiye Birleşik Veri Tabanı, 2013) (15)

Şekil 4. Tüm yaş gruplarındaki kadınlarda en sık görülen bazı kanserlerin bu grup içindeki yüzde dağılımları (Türkiye Birleşik Veri Tabanı, 2013) (15)

6

KOLON KANSERİNİN MOLEKÜLER MEKANİZMASI

Kolon kanseri, normal bir dokuda büyümeyi denetleyen moleküler mekanizmaların bozulmasına neden olan genetik mutasyonların birikimi sonucu ortaya çıkmaktadır (8). Kolorektal karsinogenezin ilk aşamasında, hücre büyümesi ve apoptozis arasındaki dengeyi etkileyen ve histopatolojik olarak tespit edilemeyen oldukça hassas olaylar gerçekleşmektedir. Normal bir epitel hücresinin neoplazik sürece girmesi için, bir takım genetik değişiklikler meydana gelmelidir. Bu genetik değişimler, iki mekanizma ile incelenmektedir (16).

a. Birinci yoldaki genetik değişimler: Çoğu kolon kanserinde 5. kromozom üzerinde APC geni delesyonu, K-ras proto-onkogeninin nokta mutasyonu, DCC geninin kaybı ve 17. kromozom üzerindeki p53 geninin kaybı veya mutasyonu gözlenmektedir (Şekil 5).

b. İkinci yoldaki genetik değişimler: DNA mismatch tamir genlerinin (MMR) mutasyona uğraması sonucu oluşan DNA replikasyon hataları vardır. hMSH2, hMLH1 gibi MMR genlerinde oluşan bozukluklar ise, mikrosatellit dengesizliğe sebep olur (17).

Tümör baskılayıcı genler, her iki allel geninde mutasyon meydana gelmesi sonucu aktivitelerini kaybetmektedir. Birinci yolda, tümör baskılayıcı bir gen olan APC geninin inaktivasyonu ile adenom-karsinom süreci başlar (16).

Ardından K-ras geninde mutasyon gerçekleşmektedir. K-ras geni, kolon kanseri patogenezinde rol alan bir proto-onkogendir. 12. kromozomun kısa kolunda yerleşmiştir. Plazma membranının içinden efektör moleküllere sinyal iletimini sağlayan, intrensek GTP-az aktivitesine sahip bir protein kodlar (18).

Hücre büyümesini ve bölünmesini uyaran herhangi bir dış uyarı ile K-ras geni, GTP’ye bağlanır ve aktif hale geçerek uyarıyı hücre içi ileti yollarına aktararak hücre büyüme ve bölünmesinde fizyolojik rol oynar. K-ras mutasyonu ile GTP-az aktivitesi ortadan kalkar ve hücre proliferasyonu düzensizleşir (19). Kolon kanserlerinin %50’sinde, Ras gen mutasyonlarına rastlanmaktadır (20).

Bir sonraki aşama, DCC geni mutasyonudur. Adenomların gelişiminde DCC mutasyonları geç dönemde saptanmaktadır. DCC geni, 18. kromozomun kısa kolunda (18q21) bulunmaktadır. DCC geni (18q), hücre-hücre adezyonunu ve hücre matriks ilişkisini düzenler. DCC mutasyonları, kolorektal kanserlerin %70’inde saptanmaktadır ve varlığı prognozu olumsuz yönde etkilemektedir (21,22).

7

Son olarak ise, bir tümör baskılayıcı gen olan p53’ün kaybı meydana gelir. p53 geni 17. kromozomun uzun kolunda yer almaktadır. p53 geni, hasarlı DNA'nın tamirini başlatır ve tamiri mümkün olmayan hücreleri ise apoptoza yönlendirir (23).

Şekil 5. Genetik değişikliklerin birikimi (24)

p53 geni mutasyona uğradığında, apoptozisi başlatma görevini yerine getirememekte ve bu da çeşitli tipte tümörlerin gelişmesine neden olmaktadır. Kolorektal kanserlerin %75’inde, p53 geni mutasyona uğramıştır. Kolorektal adenomlarda nadiren görülmektedir ve bu nedenle p53 geni, mutasyonunun kolorektal karsinogenezin geç döneminde ortaya çıktığını düşündürmektedir (1).

İkinci yolda da mutasyonların birikimi söz konusudur ancak, mutasyonların gerçekleştiği genler farklıdır. Bu yolla gelişen kolon kanserlerinde başlangıç noktası, DNA mismatch tamir genlerinin mutasyona uğraması ve bunun sonucunda DNA tamirinde aksaklıkların meydana gelmesidir (25). Çoğunlukla hMSH2 (%40-50) ve hMLH1(%20-30) genlerinde mutasyon görülmektedir (26).

MMR genlerinde ortaya çıkan mutasyonlar, DNA’nın yapısında bulunan mikrosatellitlerde değişikliklere yol açarlar. Bu tabloya mikrosatellit instabilite denir. Böyle bir genomik kararsızlık, kolon karsinogenezinde önemli rol oynamaktadır. Mikrosatellitlerin replikasyon hatalarına yatkın olması ve kritik öneme sahip genlerde giderek çok sayıda mutasyona sebep olması sonucunda malign fenotip ortaya çıkmaktadır (23).

8

KOLON KANSERİNİN SINIFLANDIRILMASI Kalıtsal Sendromlar

Familyal adenomatöz polipozis (FAP): FAP, otozomal dominant geçişli kalıtsal bir hastalıktır ve kalıtsal kolorektal kanserlerin %1’ini oluşturur. FAP, 5. kromozomun uzun kolu üzerinde (5q21) bulunan, adenomatöz polipozis coli (APC) geninin mutasyonu sonucu meydana gelmektedir (27).

APC, wnt/β-katenin sinyal yolunda rol oynayan bir tümör baskılayıcı gendir (28). Üç farklı wnt sinyal yolağı vardır (29) ve bunlardan wnt/β-katenin kanser gelişiminde rol oynamaktadır (Şekil 6).

Şekil 6. Wnt/β-katenin sinyal yolağı (30)

Wnt/β‐katenin sinyal mekanizması aktif olduğu zaman, wnt hedef hücre zarında bulunan reseptörlerine (Fz ve LRP5/6) bağlanmaktadır (31). Dishelleved (Dvl) proteini ve LRP5/6 reseptörünün hücre içi kısmı fosforillenir (32). Fosforillenme reaksiyonları ve hücre zarından sitoplazmaya aktarılan sinyalin hedefi yıkıcı komplekstir (33). β‐katenin’in yıkımına neden olan bu kompleks, wnt sinyalinin başlamasıyla inaktif hale gelir ve β‐katenin’i fosforileyemez (34). Fosforillenemeyen β‐katenin, sitoplazmada birikir. Biriken β katenin, çekirdekte transkripsiyon faktör ailesinden TCF/LEF ile bağlanır ve hedef genlerin

9

ekspresyonunu uyarır. β katenin-TCF/LEF sistemi tarafından aktive edilen genlerden bazılarına, siklin D1, c-myc gibi hücre siklusunu düzenleyen genler örnek olarak verilebilir

(35).

Sinyal mekanizması inaktif olduğu zaman ise, wnt proteini reseptörüne bağlanamaz ve bu nedenle Dvl proteini ve LRP5/6 reseptörünün hücre içi kısmı fosforillenemez. Fosforillenme reaksiyonları etkisiyle dağılan yıkıcı kompleks, aktif durumda kalır (34,36,37).

APC‐GSK3β‐CK1-Axin’den oluşan kompleks, β katenin’in proteozom tarafından tanınmasını sağlar ve yıkımına yol açar. β katenin proteini yıkılmış olduğundan, çekirdeğe giremez ve bu şekilde, wnt/β-katenin sinyal yolunun hedeflediği genlerin transkripsiyonu gerçekleşmemiş olur (38).

Herediter non-polipozis kolorektal kanser (HNPCC): HNPCC, Lynch sendromu olarak da bilinir ve tüm kalıtsal kanserlerin %4-5’ini oluşturur (39). Otozomal dominant olarak geçiş gösterir. HNPCC’deki genetik kusur, MMR genleri olarak bilinen MSH2, MLH1, PSM2 ve MSH6 genlerindeki mutasyonlarla ilişkilidir (28).

HNPCC’deki tümörler, mikrosatellit instabilite gösterir. Mikrosatellitler, genom boyunca tekrarlanan, kısa nükleotit bölgeleridir. Hatalı eşleşme tamir genlerindeki mutasyonlar, mikrosatellitlerde değişiklere yol açar. Bu duruma, mikrosatellit kararsızlığı denir. Bu kararsızlık, kolon karsinogenezinde önemli bir mekanizmadır. MSI hassas genlerde gittikçe fazla mutasyona yol açar ve sonuç olarak malign fenotip ortaya çıkmış olur (23).

HNPCC tanısı Amsterdam II kriterleriyle belirlenmiştir. Bunlar:  Ailede en az 3 bireyde HNPCC ile ilişkili kanser saptanmalıdır.  Bu üç kişiden birisi, diğer iki kişinin 1. derecede akrabası olmalıdır.  Art arda en az iki nesilde görülmüş olmalıdır.

 Bu fertlerden en az birinde 50 yaşından önce kolorektal kanser gelişmelidir.  Ailesel adenomatöz polipozis hariç tutulmalıdır.

 Kolorektal kanser tanısı patolojik incelemeyle doğrulanmalıdır (40).

Sporadik Sendromlar

Sporadik kanser tipinde, ailedeki kanserler kalıtımsal olmayan nedenler yüzünden ortaya çıkar. Sporadik kanserlerde, normal epitel hücresinden adenom oluşması ve ardından adenom-karsinom sürecinin başlaması yaklaşık olarak 10 yılı almaktadır. Kalıtsal kanserlerde ise, bu

10

süreç daha kısa sürmektedir (1). Sporadik kolon kanserlerinin %80’inde, APC geni mutasyona uğramıştır (22).

HÜCRE DÖNGÜSÜ

Hücre döngüsü, hücrelerin gelişimi ve çoğalmaları için programlanmıştır (41). Normalde hücreler uyaranlara bağlı olarak sadece gereken durumlarda bölünmektedir, ancak bu durum kanserli hücrelerde farklıdır. Kanserli hücrelerde oluşan mutasyonların sonucu, sağlıklı hücrelerde görülen kontrollü büyüme süreci kaybolmuştur (42). Kanser hücrelerinde çoğunlukla hücre döngüsünün kontrol edilmesini etkileyen genetik kusurlar vardır (43).

Hücre döngüsü dört aşamada gerçekleşmektedir (Şekil 7).

G0 evresi: İstirahat fazıdır. Hücreler bir bölünme sinyali almadıkları sürece, hücre

siklusunun aktif fazlarına girmezler ve G0 fazında beklerler (44).

G1 evresi: DNA replikasyonu için gerekli hazırlıkların yapıldığı evredir. RNA ve

protein sentezi olur.

S evresi: Bu evre sentez evresidir. DNA replikasyonu gerçekleşir ve DNA miktarı iki katına çıkar.

G2 evresi: Bu evrede RNA ve protein sentezi gerçekleşir, hücre büyümeye devam

eder. Hücre mitoza hazırlanır.

M evresi: Bu evrede hücre bölünür ve aynı genetik materyale sahip iki yeni hücre meydana gelir.

11

Hücre döngüsünde, G1/S, G2/M ve M noktalarında kontrol noktaları vardır. Bu kontrol

noktalarında, hücrenin döngüye devam edip etmeyeceğine karar verilir (46). Hücrenin G1

fazından S fazına geçebilmesi için, DNA’nın hasarsız olması gerekmektedir. Eğer DNA hasarlı ise, hasar onarılana dek hücre G1/S kontrol noktasında durur. Hasar onarılamayacak

durumda olduğunda ise, kontrol noktasındaki bu durma süresi p53’ün girmesi ile uzatılmaktadır (43).

İnsanda kanserlerde en sık p53 geni mutasyonlarına rastlanmıştır. p53, bir hücrede DNA hasarı olduğunda, hücre döngüsünü inhibe eder ve hücreye DNA onarımı için zaman kazandırır. Hasar tamir edilemediğinde ise, hücre apoptozise gider (46). p53 geninin mutasyona uğraması sonucu DNA onarımı gerçekleşememekte ve hasarlı hücreler çoğalarak tümör dokusu oluşturmaktadır (47).

APOPTOZİS

Apoptozis (programlanmış hücre ölümü), hücre intiharı olarak da bilinen fizyolojik bir olaydır. Apoptozis, organizmada biyolojik görevini tamamlamış ya da hasar görmüş hücrelerin yok edilmesinde görev alır. Çok hücreli organizmalarda, hücre çoğalması (proliferasyon) ve hücre ölümü (apoptozis) arasında daima bir denge vardır. Bu denge, doku homeostazisi sağlanması açısından büyük önem taşımaktadır. Bu dengenin bozulması, birçok hastalığın patogenezinde rol oynamaktadır. Aynı zamanda azalmış apoptozisin ve artmış proliferasyonun kanser gelişiminde rol oynadığı düşünülmektedir (48).

Apoptozis terimi, ilk defa Kerr ve arkadaşları tarafından 1972 yılında kullanılmıştır ve canlı dokulardaki hücre azalmalarından sorumlu olan, yapısal olarak özgün bir hücre ölüm tipi olarak tanımlanmıştır (49).

Apoptozisin Aşamaları

Apoptozis, enerjiye (ATP) bağımlı fizyolojik bir süreçtir (50). Apoptozis, belirli morfolojik ve biyokimyasal değişikliklerle karakterize edilir. Bunlar; hücre büzülmesi, DNA’nın fragmentlerine ayrılması ve membranın tomurcuklanmasıdır (51). Apoptozise giden bir hücrede meydana gelen değişiklikler, şu şekilde gerçekleşmektedir. Öncelikle hücreler birleşme bölgelerinden ayrılır, yüzeyindeki organellerini kaybeder. Hacimlerinde azalma olur ve hücre büzülür. Daha sonra, hücre membranında kabarcık şeklinde yapılar oluşmasıyla membran tomurcuklanması oluşur ve son olarak hücre apoptotik cisim denilen sitoplazma ile çevrili kromatin parçalarından oluşan yapılara parçalanır. Apoptotik hücreler, makrofajlar

12

tarafından tanınır ve fagosite edilir (Şekil 8). Apoptotik cisimlerin makrofajlar tarafından tanınması, hücre membranındaki bazı değişikliklerle olur. Normal bir hücrede plazma membranının iç yüzeyinde bulunan fosfotidilserin, apoptozise uğrayacak hücrelerde membranın dış yaprağına göç etmişlerdir. Fagositik hücrelerin reseptörleri, fosfotidilserin ile bağlanarak fagositozu uyarır (48).

Şekil 8. Apoptoz sırasında hücrede meydana gelen morfolojik değişiklikler (52)

Apoptozis’in Düzenlenmesi

Apoptozis’in düzenlenmesinde; kalsiyum, bcl-2 ailesi, p53, kaspazlar, sitokrom-c ve mitokondri rol oynamaktadır.

Bcl-2 ailesi, iki gruptan oluşur. Birbirine zıt etkilere sahip bu gruplar, apoptozisi

düzenlemede önemli role sahiptir. Bu gruplardan biri pro-apoptotik, diğeri ise anti-apoptotiktir. Bu üyeler Tablo 1’de gösterilmiştir (53).

Tablo 1: Pro-apoptotik ve anti-apoptotik üyeler (53) Anti-apoptotik Proteinler Pro-apoptotik Proteinler

Bcl-2 Bax Bcl-xL Bak Mcl-1 Bad Bcl-xS Bid Puma Noxa

Bcl-2 gen ailesi: Pro-apoptotik gruplar apoptozisi indükleyici özellik taşırken, anti-apoptotik grup apoptozisi baskılayıcı özellik taşır. Pro-anti-apoptotik olanlar mitokondriden

13

sitokrom c’nin salınmasını indükler, anti-apoptotik olanlar ise mitokondriden sitokrom c salınımını engellerler (54). Hücrelerin apoptoza eğilimi, anti-apoptotik ve pro-apoptotik gruplar arasındaki dengeye bağlıdır. Pro-apoptotik proteinler fazla olduğunda, hücre apoptozise eğilimlidir, anti-apoptotik proteinler fazla olduğunda hücre apoptozise daha az eğilimlidir (53).

p53 geni: p53 geni, DNA hasarı oluştuğunda hasar onarılabilecek düzeyde ise, hücre siklusunu G1 fazında durdurarak S fazına geçmesini engeller ve hücreye DNA hasarını tamir

için zaman kazandırır. Hasar tamir edilemeyecek kadar büyük olduğunda ise, p53 hücreyi apoptoza göndererek hücrenin ölümünü sağlar. p53’ün apoptozisi indüklemesi, Bcl-2/Bax oranını değiştirmesi ve bax’ın ekspresyonunu artırması yoluyla gerçekleşir. Bax’ın miktarının artması, hücreyi apoptoza götürür (55).

Kaspazlar: Kaspazlar, Sistein Aspartat Spesifik Proteaz olarak tanımlanan bir protein ailesidir. Aspartik asitten sonraki peptid bağını kırarlar. Kaspazlar, ilk sentezlendiklerinde zimojen halde bulunurlar. Apoptozis indüklendikten sonra, aktif kaspaz formuna dönüşürler. Kaspazlar üçe ayrılırlar (Tablo 2) (56).

Tablo 2. Kaspazlar (56)

Kaspaz Başlatıcı kaspazlar 2, 8, 9, 10 Efektör (Hedef) kaspazlar 3, 6, 7 İnflamatuar kaspazlar 1, 4, 5

Başlatıcı kaspazlar, ölüm reseptör yolağı ve mitokondriyal bütünlük yolağı adlı iki ana sinyal yolağı tarafından aktive edilir. Hücrenin apoptotik uyarıyı almasıyla aktive olan başlatıcı kaspazlar, efektör kaspazları aktive ederler. Efektör kaspazlar ise, kendisi ile ilişkili proteinleri parçalarlar ve böylece apoptotik hücrede görülen morfolojik değişimleri meydana getirirler (56).

Sitokrom c: Mitokondri iç membranında bulunan sitokrom c, elektron transport zincirinin bir üyesidir. Sitokrom c’nin mitokondri membranından sitoplazmaya salınımı Bcl-2 ailesine ait proteinler tarafından denetlenmektedir. Sitokrom c’nin mitokondriden

14

sitoplazmaya salınımı, apotozisi aktive eder ve bu apoptotik süreçte geri dönüşü olmayan bir yola girildiği anlamına gelir. Sitokrom c, sitoplazmaya salındıktan sonra apoptoz aktive edici faktör-1 (Apaf-1) ve pro-kaspaz–9 ile apoptozom kompleksini oluşturur. Prokaspaz-9, aktif kaspaz 9’a dönüşür. Aktive olan kaspaz-9, diğer kaspazları kaskad şeklinde aktifleştirir ve hücreyi ölüme götürür (54).

Apaf-1: Memelilerde mitokondri aracılıklı apoptoziste kaspaz kaskadının başlaması için kaspaz-9’un aktivasyonuna ihtiyaç vardır. Kaspaz-9’un aktivasyonu ise, apaf-1 tarafından gerçekleştirilir (57). Apaf-1, sitokrom c ve prokaspaz-9 ile birleşir ve apoptozom kompleksini oluşturur. Prokaspaz-9, aktif kaspaz-9’a dönüşür. Aktive olan kaspaz-9, diğer kaspazları kaskad şeklinde aktive eder ve apoptoz meydana gelir (54).

Apoptozis Mekanizması

Ölüm reseptörleri yolağı: Ölüm reseptörleri yolu olarak bilinen bu yol, hücre ölüm reseptörleri olan Fas ve TNFR-1’e kendi ligandlarının bağlanmasıyla aktifleşir (Şekil 9). Ligandların bağlanmasıyla ölüm uyarısı alınmış olur. Reseptörlerin aktive olmasından sonra, Fas reseptörü kendi ölüm bölgesi FADD ile TNF reseptörü ise TRADD ile etkileşime girer (58). FADD’ın kendisinde ve prokaspaz-8’de bulunan ölüm efektör alanı aracılığıyla FADD prokaspaz-8’e bağlanır. Bu bağlanma sonucunda, ölüm uyarıcı kompleks (DISC) oluşur. DISC’teki prokaspaz-8 oto katalizle aktifleşerek, aktif kaspaz-8’i oluşturur. Aktif kaspaz-8, iki yolla kaspaz-3’ü aktive eder. Ya doğrudan kaspaz-3’ü aktive eder ya da Bid’i keserek aktif formu olan tBid’i oluşturur ve dolaylı olarak instrinsik mekanizmada kaspaz-9’u aktive ettikten sonra kaspaz-3’ü aktive eder. Aktifleşen kaspazlar hücreyi ölüme götürür (59).

15

Mitokondriyal Yolak: Reseptör aracılı olmayan bir yolak olan mitokondriyal yolak (Şekil 10); oksidatif stres, DNA hasarı, hipoksi, toksinler, radyasyon, büyüme faktörü eksikliği gibi nedenler tarafından programlı hücre ölümünü uyarmaktadır. Bu uyarılar, mitokondri membranının geçirgenliğinin bozulmasına yol açar (61). Membranın geçirgenliğinin bozulması, mitokondri membranının porlarından sitoplazmaya sitokrom c salınmasına neden olur (62). Mitokondri membranından salınan sitokrom c, apaf-1’e bağlanır ve ardından ATP’ye bağlanmasıyla apoptozom kompleksi oluşur. Prokaspaz-9, bu komplekse bağlanır ve aktif kaspaz-9’a dönüşür. Aktive olan kaspaz-9, prokaspaz-3’ü aktive eder. Aktif kaspaz-3, diğer kaspazları kaskad şeklinde aktive etmeye devam eder ve böylece hücre ölümü gerçekleşmiş olur.

Şekil 10. Mitokondriyal yolak (60)

Mitokondriyal yolağın kontrolü, Bcl-2 ailesine ait anti-apoptotik ve apoptotik proteinlerin dengesine bağlıdır. Apoptotik proteinler, membranlarda kanallar oluşturma özelliğine sahiptir. Anti-apoptotik proteinler ise, membranlarda kanal oluşumu üzerinde zıt etkiye sahiptir (54).

Anti-apoptotik ve apoptotik proteinlerin mitokondri üzerindeki etkisiyle ya sitokrom c’nin sitoplazmaya salınımı gerçekleşir ve apoptozis başlar ya da sitokrom c’nin sitoplazmaya salınımı engellenerek apoptozis baskılanır (63).

16

DOĞAL ÜRÜNLERİN TEDAVİDE KULLANIMI

Bitki, mantar ve mikroorganizma kaynaklı doğal ürünlerin tedavide ve hastalıkları önlemede kullanımı uzun bir geçmişe dayanmaktadır (64). Kimyasal sentez ile ilaç eldesinde çok büyük bilimsel ve teknolojik gelişmeler kaydedilmesine rağmen, doğal ürünlerden elde edilen ilaçlar, ilaç keşiflerine çok büyük katkı sağlamaktadır (65).

2009 yılından itibaren piyasadaki ilaçlar incelendiğinde bu ilaçların yarıdan fazlasının doğal kaynaklardan elde edildiği görülmektedir. Bitki, mikroorganizma ve deniz organizmaları gibi doğal kaynaklardan elde edilen ya da izole edilen bu maddelerden, semi sentez yoluyla geliştirilen ilaçlar, kemoterapotik ajanların önemli bir yüzdesini oluşturur (66). Dünyada onaylanan ve kullanılan kemoterapötik ilaçlar ve kaynakları incelendiğinde, bu ilaçların %60’ının doğal ürünlerden elde edildiği görülmektedir (65).

Tablo 3, şu anda klinik uygulamada kullanılan ve doğal ürünlerden elde edilen ajanlardan birkaçını göstermektedir (65).

Tablo 3. Doğal ürünlerden geliştirilen ilaçlar (65)

İlaç Medikal

kullanımı Etki mekanizması Kaynağı

Aspirin

Analjezik, antiinflamatuar,

antipiretik

COX’un inhibisyonu Bitki

Kafein Uyarıcı Adenozin Reseptör Antagonisti Bitki Kodein Analjezik, antitusif Opioid reseptör antagonisti Bitki

Digoksin Atrial fibrilasyon ve

kronik kalp yetmezliği Na

+_/K+_{ATPaz’ın inhibisyonu Bitki}

Eugenol Diş ağrısı Duyu sinirlerinin uyarımını azaltır. Bitki Morfin Analjezik Opioid reseptör antagonisti Bitki Pilokarpin Glokom Muskarinik reseptör antagonisti Bitki

Kinin Malarya Profilaksisi Malarya parazitinde protein sentezi

inhibisyonu Bitki

17

Tablo 3. (Devam) Doğal ürünlerden geliştirilen ilaçlar (65) Siklosporin A İmmünosüpresan T lenfositlerin klonal

proliferasyonunun inhibisyonu Mikroorganizma Penisilin Antibiyotik Peptidoglikan hücre duvarının

sentezinin inhibisyonu Mikroorganizma Tetrasiklin Antibiyotik

Ribozomun 30 S’lik alt ünitesine bağlanarak protein sentezi

inhibisyonu

Mikroorganizma

Aurantoside Mantar önleyici Tubulin polimerizasyonunun

inhibisyonu Deniz organizmaları Spongistatin Mantar önleyici Tubulin polimerizasyonunun

inhibisyonu Deniz organizmaları Manoalide Analjezik,

anti-inflamatuar Fosfolipaz A2 inhibisyonu Deniz organizmaları Bitki Kökenli Ajanlar

Günümüzde, çeşitli bitkisel kaynaklı bileşikler kanser tedavisinde kullanılmaktadır (Tablo 4). En önemli örneklerden biri, Madagaskar yağmur ormanlarında bulunan ve

Catharanthus roseus’dan elde edilen vinca alkaloid ailesidir. Vinca alkaloid ailesinden olan

Vinkristin, Hodgkin hastalığı ve bazı lösemi türlerinin tedavisinde artan bir başarı göstermiştir. Vinkristin, mikrotübül polimerizasyonunu inhibe ederek etki göstermektedir.

Bir başka örnek ise, oldukça aktif bir ajan olan ve doğal üründen elde edilen etoposittir. Etoposit, bir başka doğal üründen elde edilen bleomisin ve sisplatin ile kombine edildiğinde, testis tümörü tedavisinde yüksek iyileşme oranı göstermiştir (65). Etoposit,

Podophyllum peltatum ve Podophyllum emodi bitkilerinden elde edilen epipodofilotoksin’dir.

Etoposit; akciğer kanseri, non-Hodgkin’s lenfoma, lösemiler, yumuşak doku sarkomu ve nöroblastoma gibi hastalıklarda, kemoterapötik ajan olarak kullanılmaktadır (61). Etoposit, bir topoizomeraz II inhibitörüdür. Topoizomeraz II’ye bağlanır ve DNA’nın zincirleri üzerinde kırıklar oluşturur (67).

Taksan sınıfı bileşikler olan paklitaksel ve dosetaksel; meme, ovaryum ve diğer kanser türlerine karşı belirgin anti-tümör aktivitesi gösterirler (65). Paklitaksel, 1971 yılında ABD’de yetişen Taxus brevifolia’nın kabuğundan izole edilmiştir. Yarı-sentetik analogu olan dosetaksel, Taxus baccata’nın yapraklarından elde edilmiştir. Paklitaksel ve onun yarı sentetik analogu olan dosetaksel etkilerini, hücredeki mikrotübüllerin toplanmasını artırarak ve mikrotübülleri stabilize ederek göstermektedir (68).

18

Yine kamptotesin türevleri olan irinotekan ve topotekan ilaçları, sırasıyla kolorektal kanser ve ovaryum kanserine karşı belirgin anti-tümör aktivitesi gösterirler. Kamptotesinler,

Camptotheca acumimata ağacından izole edilen bir alkaloittir. Kamptotesinler, DNA

topoizomeraz I enzimini inhibe ederek etkilerini gösterirler (65). Başlıca bitkisel kemoterapötik ilaçlar ve elde edildiği kaynaklar, Tablo 4’te belirtilmiştir (69).

Tablo 4. Başlıca bitkisel kemoterapötik ilaçlar ve elde edildiği bitkiler

İlaç sınıfı Bu sınıftan ilaçlar Kaynak bitki

Vinca alkaloitleri Vinblastin, vinkristin (ve semisentetik türevleri vindesin, vinorelbin)

Vinca rosea (Catharanthus roseus)

Taksanlar Paklitaksel (ve semisentetik türevi

dosetaksel) Taxus brevifolia

Kamptotesinler Semisentetik kamptotesin türevleri

topotekan, irinotekan Camptotheca acuminata Epipodofilotoksinler Semisentetik podofilotoksin türevleri

etoposid ve teniposid Podophyllum peltatum

Mikroorganizma Kökenli Ajanlar

Doğal ürünlerden kemoterapotik ajanların eldesinde, bitkilerin yanısıra mikroorganizmalarda önemli bir drog kaynağı olarak görülmüştür (Tablo 5). Aktinomisin, bleomisin, daktinomisin, mitomisin ve antrasiklin türevleri olan doksorubisin, daunorubisin, epirubisin, idarubisin gibi mikroorganizma kökenli kemoterapötik ilaçlar, günümüzde en etkili anti-tümör ilaçlar arasında bulunmaktadır (65,69).

Tablo 5. Mikroorganizma kökenli kemoterapötik ajanlar ve elde edildiği mikroorganizmalar (69)

İlaç sınıfı Bu sınıftan ilaçlar Kaynak mikroorganizma Antrasiklin antibiyotikler Daunorubisin, doksorubisin (ve

semisentetik türevleri epirubisin, idarubisin)

Streptomyces peucetius

Glikopeptit antibiyotikler Bleomisin A2 ve B2 Streptomyces verticillus

Polipeptit antibiyotikler Daktinomisin Streptomyces parvulus

19

Klinikte kullanılan bu kemoterapötik ilaçlar, Streptomyces bakterilerinin çeşitli türlerinden elde edilmiştir. 1940 yılında, ilk mikroorganizma kökenli kemoterapötik ajan olan aktinomisin serisi ilaçlar izole edilmiştir. Aktinomisin D, bu gruptaki en önemli ajan olup, koryokarsinoma ve çocukluk çağı solid tümörleri tedavisinde etkilidir (70).

Antrasiklinler, klinikte en yaygın kullanılan anti-tümör antibiyotikler arasındadır. Antitümör aktivitelerini, topoizomeraz II enzimini inhibe ederek gösterirler (65). Lenfoma, lösemi, meme kanseri ve birçok kanser türünün tedavisinde kullanılmaktadır (70).

Deniz Organizmalarından Elde Edilen Kemoterapötik Ajanlar

Deniz canlıları, doğal ürünler ve bileşikler elde edilmesi açısından oldukça zengin bir kaynaktır (65). Bu sebeple denizler, yeni ilaç olmaya aday moleküllerin keşifleri için araştırılmaktadır ve elde edilen bu maddeler antikanser, antiviral, antibakteriyel aktiveleri açısından incelenmektedir (69).

Son 30 yıldır deniz organizmalarından 3000 den fazla yeni madde elde edilmiştir ve bu durum, denizlerin yeni maddeler elde etme açısından devasa bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir (65).

Sitarabin ve onun türevi olan gemsitabin, deniz organizmalarından elde edilen bir kemoterapötik ajan olup, Cryptotheca crypta adı verilen bir deniz süngerinden elde edilmiştir. Sitarabin, lenfoma ve lösemi tedavisinde kulanılmaktadır. Gemsitabin ise; meme, mesane, akciğer ve pankreas kanserlerine ait solid tümörlere karşı, anlamlı bir anti-tümör etki göstermektedir (69).

Günümüzde deniz organizmalarından elde edilen ilaç olmaya aday moleküller kullanılarak yeni kemoterapötik ajanlar elde etmek amacıyla, çeşitli faz araştırmaları ve klinik araştırmalar yapılmaktadır (69).

ANKAFERD BLOOD STOPPER®

Bitkisel bir ekstrakt olan ABS Türk hekimliğinde hemostatik ajan olarak kullanılır (5). ABS’nin içeriğinde Glycyrrhiza glabra (meyan), Alpinia officinarum (havlıcan), Thymus

20

Ankaferd Blood Stopper’ın Bileşenleri

Isırgan otu (Urtica Dioica): Ilıman iklim bölgelerinde yetişen ve yabani bir ot olan ısırgan otu, Urticaceae familyasına aittir. Bitki, yakıcı tüylerle kaplıdır ve bu tüylerde çeşitli kimyasallar bulunmaktadır. Bu yakıcı özelliği, yapısındaki histamin, formik asit, kolin ve serotoninden kaynaklanmaktadır (71).

Isırgan otunun yapısında, çok sayıda kimyasal madde bulunmaktadır. Bunlar; karetenoidler, flavonoidler, klorofil, lesitin, steroller, mineraller, taninler, aminoasitler, aglutinindir (72).

Isırgan otu, pek çok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Isırgan otunun; antimikrobiyal (73,74), analjezik ve ağrı kesici (75), antinflamatuar (76), antibakteriyel (77), diüretik (78), hipotansif ve antidiyabetik (79,80), kardiyovasküler (81), ve antiromatizmal (82) özelliklerini bildiren araştırmalar mevcuttur.

Yapılan çalışmalarda; benign prostat hiperplazisi tedavisinde ısırgan otunun çok etkili olduğu (83), başka bir çalışmada ise vasküler endotelde nitrik oksit üretimini arttırarak damarlarda vazodilatasyona neden olduğu bildirilmiştir (81).

Havlıcan (Alpinia officinarum): Havlıcan, Zingiberaceae ailesine ait çok yıllık bir bitkidir (84). Çin’de geleneksel tedavi yöntemi olarak karın ağrısını hafifletmek, şişkinliği azaltmak, kan dolaşımını hızlandırmak ve soğuk algınlığı tedavisinde kullanılır. Bitkinin rizom kısmı, tıbbi olarak kullanılır. Bu bitkiden çok sayıda kimyasal bileşen elde edilmiştir. İki temel bileşeni, diarilheptanoidler ve galangindir. Alpinia officinarum ve temel bileşenleri antioksidan, anti-platelet, anti-proliferatif, anti-emetik, anti-hepatotoksik ve anti-inflamatuar etkilere sahiptir (85).

Yapılan çalışmalar; Alpinia officinarum ekstraktının ve temel bileşenlerinin, karaciğer, akciğer, nöroblastoma ve meme kanseri gibi çok sayıda kanser hattında anti-kanser etkisinin olduğunu göstermektedir (86).

Meyan (Glycyrrhiza glabra): Meyanın kökü ve rizomu yüzyıllardır tedavi amaçlı kullanılmaktadır (87). Bu bitki bronşit, alerji, soğuk algınlığı, boğaz ağrısı ve tüberküloz gibi solunum yolu hastalıkları, reflü, gastrit, cilt hastalıkları ve karaciğer hastalıklarında yatıştırıcı ve koruyucu olarak kullanılmaktadır (88).

Meyan kökünün ana maddeleri; triterpen saponinler, çoğunlukla glycyrrhizin (%2–9),

21

bileşenler ise; triterpen saponinler olan glabranin A, glabranin B, glycyrrhetol, glabrolide, isoglabrolide, izoflavon olan formononetin, glabrone, neoliquiritin, hispaglabridin A ve B, kumarin olan herniarin, umbelliferone, triterpen sterol olan onocerin, h-amyrin, stigmasterol’dur (89).

Glycyrrhiza glabra, antasid, antiülser, antiinflamatuar, balgam söktürücü, diüretik,

anti-piretik, antimikrobiyal, anksiyolitik, anti-konvülsan ve hafıza güçlendirici etkilere sahiptir (89).

Glycyrrhiza glabra’nın ana maddesi glycyrrhizin; anti-viral, anti-inflamatuar ve

antioksidan etkilere sahiptir (87). Yapılan bir çalışmada, Glycyrrhiza glabra ekstraktının anti-anjiogenik ve anti-tümör aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Glycyrrhiza glabra ekstraktının in vivo ve in vitro çalışmalarda Ehrlich asit tümör hücrelerinin proliferasyonunu inhibe ettiği ve anjiogenezi uyaran vasküler endotelyal büyüme faktörünü inhibe ederek, anti-tümöral etki gösterdiği bildirilmiştir (88).

Kekik (Thymus vulgaris): Thymus vulgaris, Lamiaceae familyasına ait bir tıbbi bitkidir. Aromatik ve tıbbi özellikleri, kekiğin dünya çapında ünlü bir bitki olmasına neden olmuştur (90). Kekik türleri; güçlü antibakteriyel, antifungal, antiviral ve antioksidan özellik göstermektedirler (91). Thymus vulgaris ekstraktı; geleneksel olarak antiastmatik, bronkodilatör, antitüssif, antispazmodik etkilerinden dolayı kullanılmaktadır (92).

Kekik bitkisinin ana bileşiği, karvakrol ve timoldür (93). Kekikte bulunan ana kimyasallar, uçucu yağlar (borneol, karvakrol, linalool ve timol), tanin, saponin ve triterpenik asitlerdir (94). Thymus vulgaris, polifenol ve flavonoid içeriğinden dolayı, antioksidan ve serbest radikal parçalayıcı özelliği vardır (95).

Yapılan in vitro bir çalışmada, Thymus vulgaris uçucu yağının PC-3, A-549 ve MCF-7 kanser hatlarında güçlü bir sitotoksisite gösterdiği bildirilmiştir (96). Bir başka in vitro çalışmada, Thymus vulgaris uçucu yağının skuamöz hücreli baş-boyun kanseri hücrelerinin büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir (97).

Koruk (Vitis vinifera): Vitis vinifera, dünyada ekim yapılan alan ve ekonomik değeri açısından ele alındığında en temel meyvelerden biri olduğu görülmektedir (98) ve dünyada yaklaşık 60 milyon ton üzüm üretimi yapıldığı tahmin edilmektedir (99).

Üzüm diğer meyvelerle kıyaslandığında en fazla çeşide sahip olan meyve türlerinden biri olup, 15.000’in üzerinde çeşidi bulunduğu tahmin edilmektedir (100). Bitkinin içeriğini;

22

tanenler, flavonoidler, meyve asitleri, non-flavonoidler ve fenil akrilik asit türevleri oluşturmaktadır (101). Üzüm çekirdeği; (+)-kateşinler, (-)-epikateşin ve (-)-epikateşin-3-O-gallat gibi monomerik fenolik bileşikler ve dimerik, trimerik ve tetramerik prosiyanidin açısından zengindir (102) ve bu bileşikler anti-mutajenik ve anti-viral ajan özelliği göstermektedirler (103). Üzümdeki fenolik bileşiklerin, düşük yoğunluklu lipoproteinlerin (LDL) oksidasyonunu in vitro olarak inhibe ettiği bildirilmiştir (104).

Yapılan bir çalışmada, üzüm ekstraktının güçlü bir antioksidan etki gösterdiği ve reaktif oksijen türleri ile indüklenen DNA hasarını önlediği gösterilmiştir (105,106). Başka bir çalışmada, üzüm ekstraktının skuamöz hücreli baş-boyun kanseri hücre hattında sitotoksisite gösterdiği (107) ve hayvan modellerinde tümör büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir (108).

Üzüm ekstraktının bu koruyucu özelliği için, çeşitli mekanizmalar öne sürülmüştür. Bu mekanizmalar; hücre sinyallerini ve hücre siklusu regulatörlerini düzenleyerek apoptozisi indüklemesiyle (109), hücre proliferasyonunda önemli rol oynayan topoizomeraz I enziminin inhibisyonuyla (105) ya da anjiogenezin inhibisyonuyla (110) gerçekleşmektedir. Ayrıca, üzüm ekstraktının kardiyovasküler hastalıkları önlediği (111), antimikrobiyal (102), antihipertansif (112) ve anti-ülser (113) aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir.

Ankaferd Blood Stopper Ürününün Formları

Ürün; tampon, sprey ve ampül olmak üzere 3 farklı farmasötik formda bulunur(114).

Tablo 6. Ampül formunda Ankaferd Blood Stopper®içerikleri (1_kurutulmuş

kök ekstresi, 2kurutulmuş yaprak ekstresi, 3kurutulmuş ot ekstresi)

Etken madde adı Ampül (2 ml)

Etken madde miktarı (mg)

Urtica Dioica1 _0.12

Vitis vinifera2 _0.16

Glycyrrhiza glabra2 _0.18

Alpinia officinarum2 _0.14

23

Cetuximab (Erbitux®)

Cetuximab, epidermal büyüme faktör reseptörü (EGFR)’nün ligand bağlayıcı bölgesini hedef alan kimerik, IgG1 monoklonal bir antikordur. Cetuximab etkisini hem EGFR

antagonisti olarak ve hem de antikor bağımlı hücresel sitotoksisite yoluyla göstermektedir (115).

Baş, boyun ve kolorektal kanser başta olmak üzere çoğu kanser türünde artmış EGFR etkisi vardır. Cetuximab, EGFR’ne diğer ligandların bağlanmasını önleyerek reseptör-bağımlı yolakları bloke eder (116). Bu da hücre siklusunun durması, apoptozisin uyarılması, anjiogenezin inhibisyonu, metastazın inhibisyonu, EGFR’nün sayısının hücre yüzeyinde azalması ve kemoradyoterapiye hassasiyeti arttırma gibi antitümöral etkilerin ortaya çıkmasını sağlar (116). Şekil 11’de Cetuximab’ın EGFR sinyal kaskadına etkisi gösterilmektedir.

Şekil 11. Cetuximab EGFR sinyal kaskadına etkisi (116)

Preklinik çalışmalar, Cetuximab’ın diğer sitotoksik ajanlarla birlikte kullanıldığında sinerjistik etki gösterdiğini ve tümör gelişimini inhibe ettiğini göstermiştir (117). Bu tür etkileri, Topotekanla (118) ve en önemlisi İrinotekanla (119) kombine kullanıldığında göstermektedir.

Bilhassa, Cetuximab-İrinotekan kombinasyonunun tümör gelişiminin tek bir ajanla kontrol edilemediği İrinotekan-dirençli DLD-1 ve HT-29 xenograftlarında, tümör gelişimini inhibe ettiği görülmüştür.

24

Yapılan histolojik incelemelerde, Cetuximab ve İrinotekan kombinasyonunun tümör nekrozunu artırdığı, tümör hücresi proliferasyonunu azalttığı, tümör hücresinde apoptozisi artırdığı ve tümörün damarlanmasını azalttığı gözlenmektedir (115).

Oxaliplatin

Oxaliplatin (trans-L-1,2-diamino siklohekzanoksalatoplatinyum) (Şekil 12), metastatik kolon kanseri tedavisinde güçlü bir anti-tümöral etki gösteren üçüncü nesil platin bileşiğidir (120). Oxaliplatin, platin sınıfının bir diğer üyesi olan Sisplatinden daha güçlü bir etkiye sahiptir (121).

Oxaliplatin; DNA molekülleri içinde ve DNA molekülleri arasında çapraz bağlar oluştururarak, DNA’nın replikasyon ve transkripsiyonunu inhibe eder (122). Preklinik çalışmalar, Oxaliplatin’in 5-FU ile kombinasyonunun, sinerjistik etkileşim gösterdiğini bildirmektedir (123).

Şekil 12. Oxaliplatinin moleküler yapısı (124)

Yapılan faz III klinik çalışmaları, Oxaliplatin/5-FU/Lökoverin kombinasyonunun kolorektal kanser tedavisinde güçlü bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir (123) ve bu kombinasyon FOLFOX olarak adlandırılmaktadır (125).

5-Florourasil

5-FU, günümüzde yaygın olarak kullanılan kemoterapi ilaçlarından biridir. 1957 yılından beri kolon kanserinin tedavisinde önemli bir rol oynamaktadır ve aynı zamanda meme, baş ve boyun kanseri tedavisinde de kullanılmaktadır (126).

5-FU, urasilin analogudur (Şekil 13). Urasilin C-5 pozisyonundaki hidrojen atomunun yerine, flor atomunun gelmesiyle sentezlenmiştir (127). 5-FU, hücre içine urasilin kullandığı transport mekanizmasını kullanarak girer (123). Hücre içinde, 5-FU aktif metabolitlerine dönüştürülür (127). Bu aktif metabolitlerden biri olan floro-deoksiuridin-monofosfat

25

(FdUMP), timidilat sentaz enzimine stabil bir şekilde bağlanarak, normal substratı olan deoksiuridin monofosfatın (dUMP) enzime bağlanmasını engeller (126).

Şekil 13. 5-Florourasil ve urasilin moleküler yapısı (128)

Timidilat sentaz, dUMP’nin deoksitimidin monofosfat’a (dTMP) dönüşümünü katalizleyen enzimdir. FdUMP’ın timidilat sentaza bağlanması, enzimin fonksiyonunu inhibe eder ve dTMP sentezi durur. Dolayısıyla da DNA sentezi yapılamaz hale gelir (129).

5-FU, diğer kemoterapotik ajanlarla kombine edildiğinde etkisini arttırmaktadır. Kolon kanseri tedavisinde 5-FU tek başına kullanıldığında; tedaviye yanıt oranı %10-15 iken, İrinotekan ya da Oxaliplatin gibi kemoterapotik ajanlarla ile kombine edildiğinde, kolorektal kanser tedavisine yanıt oranı %40-50‘e çıkmaktadır (127).

İLAÇLARIN KOMBİNE KULLANIMI

Kanser başta olmak üzere, diğer hastalıkların tedavisinde iki ya da daha fazla ilacın kombine olarak kullanımı yaygındır (130). İlaçların kombine şekilde kullanımlarının nedeni, tek bir ilaçla tedaviden istenilen, etkin bir sonuç alınamamasıdır (131).

İlaçların kombine kullanımındaki amaç; sinerjistik terapötik etki elde etmek, ilacın toksisitesini ve kullanılan ilacın dozunu azaltmak ve ilaç direncini en aza indirmektir (130). Toksik etkileri farklı olan ve farklı mekanizmalarla etki gösteren ilaçları kombine ederek, daha güçlü etki göstermelerini sağlamaktır (131). Böylelikle ilaçların artırılmış sitotoksik etkileri tümörü kontrol altına almayı kolaylaştırırken, aynı zamanda hastanın daha düşük dozla tedavi edilmesi ve ilacın toksik etkilerinin azaltılması sağlanmaktadır (131).

Sinerjizm, bir ilacın etkisinin diğer bir ilaçla kullanıldığında artmasıdır. Bir başka deyişle sinerjistik etki; iki ilacın kombine etkisinin, tek başlarına gösterecekleri etkinin toplamından fazla olması şeklinde tanımlanır (132). Antagonistik etki iki ilacın kombine

26

etkisinin, ilaçların tek başlarına gösterdikleri etkinin toplamından az olması, additif etki ise iki ilacın kombine etkisinin tek başına gösterdikleri etkiye eşit olması olarak tanımlanır (132).

Sinerjistik Ve Antagonistik Etkinin Belirlenmesi

Günümüzde iki ilaç kombinasyonunun etkisinin kantitatif değerlendirmesinde, Chou ve Talalay tarafından önerilen ve yaygın olarak kullanılan medyan-efekt eşitliği kullanılmaktadır (133). Medyan-efekt eşitliği, kütle korunumu kanunundan türetilmiştir. Bu eşitlik; biyokimya ve biyofizikteki Michaelis-Menten, Hill, Henderson-Hasselbalch ve Scatchard eşitliklerini kapsamaktadır. Chou ve Talalay kombinasyon indeksi (CI) teoremiyle de ilaç kombinasyonunun kantitatif değerlendirmesini yapmaktadır.

Medyan-efekt eşitliği ilacın dozu ile ilacın etkisi, sitotoksisitesi arasında en basit şekilde ilişki kurulabilmesini sağlamaktadır (130). Denklem şu şekildedir:

𝑓_𝑎 𝑓𝑢 = ( 𝐷 𝐷𝑚 ) 𝑚

D: İlacın dozu (konsantrasyonu)

Dm: Medyan-efekt doz (ilacın gücünü/potansiyelini gösteren doz)

fa: Doz tarafından etkilenen bölüm/fraksiyon

fu: Doz tarafından etkilenmeyen bölüm/fraksiyon(1-fa=fu).

m: Doz-etki eğrisinin şeklini/keskinliğini veren katsayı (m=1 ise eğri hiperbolik, m>1 ise sigmoidal, m<1 ise eğri düz sigmoidaldır).

1983 yılında Chou ve Talalay tarafından tanıtılan ve sinerjizm ve antagonizmi kantitatif olarak veren CI ise şu şekilde hesaplanır (130):

𝐶𝐼 = (𝐷1) (𝐷𝑥)1 + (𝐷2) (𝐷𝑥)2 = (𝐷1) ((𝐷𝑚)1〖[_{1 − 𝑓}𝑓𝑎 𝑎])〗 1 𝑚⁄ 1 + (𝐷2) ((𝐷𝑚)2〖[_{1 − 𝑓}𝑓𝑎 𝑎])〗 1 𝑚⁄ 2

Buradaki D1 ve D2 sırasıyla 1. ilacın ve 2. ilacın dozlarıdır. Paydadaki (DX)1, D1’in tek

başına sistemin %x’ini inhibe eden konsantrasyonudur.(DX)2, D2’in tek başına sistemin %x’ini

27

İlaçların sinerjistik, antagonistik ve additif etkileri, CI aralığına bağlı olarak belirlenmiştir. CI<1 olması sinerjizmi, CI=1 olması additif etkiyi, CI>1 olması ise antagonistik etkiyi belirtmektedir.

Kombinasyon indeksi, CompuSyn 1.0 programı tarafından hesaplanmaktadır. Program, ilaçların kombinasyonlarının verilerini analiz edip kombinasyon indeksini otomatik olarak hesaplamaktadır (130).

28

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Bu çalışma, Trakya Üniversitesi Teknoloji Araştırma ve Geliştirme Merkezi laboratuarında gerçekleştirildi.

GEREÇLER

Deneylerde kullanılan kimyasal maddeler, kitler ve cihazlar Tablo 7. ve Tablo 8.’de gösterilmiştir.

Tablo 7. Deneylerde kullanılan kimyasal maddeler

Kimyasal Madde Üretici Firma

5-Florourasil Sandoz

Ankaferd Kanama Durdurucu (ABS) Ankaferd İlaç A.Ş.

Cetuximab MERCK

Dimetil sülfoksit (DMSO) MERCK

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium1X) MULTICELL (319-020-CL) EMEM (Minimum Essential Medium Eagle’s 1X) MULTICELL (320-026-CL) Fetal Bovine Serum Capricorn Scientific

Ham’s F12 Medium, 1X MULTICELL (319-010-CL) High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems

L-Glutamin MULTICELL (609-065-E2)

MTT Biomatik (A-3338-56)

29

Tablo 7. (Devamı) Deneylerde kullanılan kimyasal maddeler

Kimyasal Madde Üretici Firma

Penisilin-Streptomisin Wisent Bioproducts

Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific

PureLink RNA Mini Kit Life Technologies SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems

Tripsin-EDTA MULTICELL (352-542-EL)

Tablo 8. Deneylerde kullanılan alet ve malzemeler

Cihaz Üretici Firma

24 ve 96 kuyucuklu hücre kültür plakaları Nest Biotechnology 96 Well Thermal Cycler Thermo Scientific, ABD 384 kuyucuklu PCR array plate Applied Biosystems CO2’li inkübatör Panasonic, Japonya

Hücre üreme flaskları, 25 cm2 _{ve 75 cm}2 _{Corning, ABD}

Inverted Mikroskop Nikon, Japonya Laminar Hava Akımlı Steril Çalışma Kabini SafeFast Elite, İtalya Soğutmalı Santrifüj Hermle, Almanya Mikroplaka ELISA okuyucu Thermo Scientific, ABD NanoDrop Optizen Nano-Q

Otomatik mikropipetler (10, 20, 100, 200, 1000 µl’lik)

Eppendorf Tali image cytometer İnvitrogen

The QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR cihazı Thermo Fisher Scientific, Türkiye

Vorteks Wisemix

YÖNTEMLER

Kolon Kanseri Hücre Hattı (HT29)

Çalışmamızda kullanılan hücreler, ATCC (Amerikan Tissue Culture Collection)’den sağlanmıştır (ATCC kodu: HTB-38).

30

Çalışma İlaçları Ve Hazırlanması

Çalışmamızda; 5-FU ve Oxaliplatin ve Cetuximab ilaçları, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Onkoloji bölümünden temin edilmiştir. ABS ise, Ankaferd İlaç A.Ş.’den temin edildi.

5-FU için 1000 µM’lık, Oxaliplatin ve Cetuximab için ise 2000 µg/ml’lık stok çözelti hazırlandı. Hazırlanan bu stok çözeltilerden, çalışma çözeltileri hazırlandı.

5-FU’nun deneyimizde kullanılacak konsantrasyonları, en yüksek doz 50 µM olacak şekilde toplamda 10 farklı konsantrasyonu hazırlandı. Oxaliplatin’in en yüksek doz 100 µg/ml olacak şekilde, Cetuximab’ın en yüksek dozu 10 µg/ml olacak şekilde, farklı konsantrasyonları hazırlandı. ABS’nin konsantrasyonları ise, 90, 72, 54, 36, 18, 9, 4.5, 2, 1 µl olacak şekilde, toplamda 9 farklı doz olarak hazırlandı.

Hücre Kültürü Teknikleri

Hücre hattının açılması: -150ºC’ de uzun süre saklanmış olan hücreler, 37ºC’de çözünene kadar bekletildi. Çözünen hücre süspansiyonuna %5 FBS içeren besiyeri eklendi ve sonra flaska konularak 37ºC’de ve %5 CO2 içeren inkübatörde inkübasyona bırakıldı. 5-6 saat

inkübasyonun sonunda, hücrenin besiyeri değiştirildi.

Hücrelerin çoğaltılması: Çalışmada kullanılan kolon kanseri hücre hattı HT-29, DMEM, EMEM, Ham’s F12, %5 FBS, %1 L-glutamin ve %1 penisilin-streptomisin içeren kültür ortamında, 37°C’de ve %5 CO2’li inkübatörde kültüre edildi. Hücrelerin üremesi, her 2

günde bir inverted mikroskopta incelendi. Konfluent olan hücrelerden pasaj yapılarak, hücrelerin çoğaltılması sağlandı.

Hücrelerin pasajlanması: Flask içerisinde yaklaşık %70’i konfluente ulaşan hücrelerden besiyeri uzaklaştırıldı. 75 cm2_{’lik flaskın içerisine, %0.05’lik tripsinden 6 ml}

eklendi. Flasklar, 37°C’de ve %5 CO2 içeren inkübatöre konuldu. İnkübatörde 5-6 dakika

bekletilerek, hücrelerin kontrollü şekilde kalkmaları sağlandı. Yüzeyden ayrılan hücreler, pipet yardımıyla 15 ml’lik tüpe alındı.

Tüpler, 1200 rpm’de 2 dakika santrifüj edilerek, süpernatant uzaklaştırıldı. Altta kalan kısmın üzerine bir miktar besiyeri konuldu ve iyice pipetaj yapılarak flasklara eklendi. Ardından flasklar inkübatöre konuldu.

31

Hücrelerin dondurulması ve saklanması: Flaskın içerisindeki hücrelere tripsin konularak, hücrelerin tutundukları yüzeyden kalkması sağlandı. Kalktığı gözlenen hücreler 15 ml’lik tüplere alınıp, 1200 rpm’de 2 dakika santrifüj edildi. Ardından süpernatant uzaklaştırılarak, altta kalan kısmın üzerine %5 FBS içeren besiyeri konuldu. İyice pipetetaj yapıldıktan sonra, hücre süspansiyonu %5 DMSO içeren cryo tüplere konuldu ve tüpler -150°C’de saklandı.

İlaçların Uygulanması

Hücrelerin 96 kuyucuklu plakalara ekimi yapıldı ve bu plakalar hücrelerin yüzeye tutunması için 24 saat inkübatörde bekletildi. 24 saat inkübatörde bekletilen 96 kuyucuklu plakalara, planlanan konsantrasyonlardaki 5-FU, Oxaliplatin, Cetuximab ve ABS, toplam 200 µl volüm içinde olacak şekilde uygulandı. 24 saat inkübasyonun ardından, plakalardan ilaçlı besiyeri tamamen uzaklaştırıldı ve plakalara taze besiyeri eklendi. 72 saat inkübasyon sonrasında hücre proliferasyonu ve sitotoksisitesi, kolorimetrik bir test yöntemi olan MTT ile değerlendirildi.

MTT deneyi sonucunda; ABS, 5-FU, Oxaliplatin ve Cetuximab kemoterapötiklerinin LD50 değerleri hesaplandı.

Elde edilen LD50 değerlerine göre, ilaç etkileşim çalışmaları yapıldı. İlaç etkileşim

çalışmaları için; ABS ve diğer kemoterapötiklerin bire bir 4, 2, 1, 1/2, 1/4 ve 1/8 LD50

konsantrasyonlarının kombinasyonunundan elde edilen değerler üzerinde, sinerjistik ve antagonistik etkiler değerlendirildi.

MTT Yöntemi

Hücre canlılığı, kolorimetrik bir test olan MTT [3-(4,5-dimetiltiazol–2-il)-difenil tetrazolium bromid] yöntemi ile belirlendi. Bu yöntemde, MTT boyası canlı hücrelere aktif olarak absorbe olur ve mitokondriyal süksinat dehidrogenaz tarafından katalizlenen bir tepkimeyle mavi-mor renkli, suda çözünmeyen formazana indirgenir. Formazan oluşumu, yalnızca aktif mitokondrinin bulunduğu canlı hücrelerde görülmektedir. Bu da, hücre canlılığının bir belirteci olarak kabul edilmektedir (134).

MTT çalışma çözeltisi, 5 mg/ml olacak şekilde hazırlandı. İnkübasyonun sonunda, MTT çalışma çözeltisinden her bir kuyucuğa 20 µl MTT çalışma solüsyonu eklendi ve 2 saat inkübasyona bırakıldı. Bu süre sonunda MTT solüsyonu boşaltılıp, dimetil sülfoksit (DMSO) eklendi. Daha sonra 492 nm’de, mikroplaka okuyuculu spektrofotometrede ölçüm yapıldı.

32

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre ile Apoptoz Tayini

Normal hücrelerin hücre zarının iç kısmında, membran lipidlerinden olan fosfotidilserin bulunmaktadır. Eğer hücre apoptoza giderse, hücre membranının iç yüzeyinde bulunan fosfotidilserin, hücre zarının dış kısmına transloke olur. Bu yer değiştirme, hücre membran bütünlüğünün bozulmadığı apoptotik hücre ölümünün erken evrelerinde meydana gelir. Annexin V, fosfotidilserine bağlanabilen bir proteindir ve floresan bir madde ile işaretlenerek, apoptotik hücre görünür hale getirilebilir. İkinci bir boya olarak ise, propidyum iyodid (PI) kullanılmaktadır. PI, canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırmaktadır (135).

Annexin V ve PI boyalarının bu özellikleri kullanılarak, hücrelerin canlı, ölü ve apoptotik durumları belirlenebilmektedir. Bunun için kullandığımız Tali Apoptosis Kit-Annexin V Alexa Flour 488 ve Propidium Iodide kit ile boyanan apoptotik hücreler yeşil floresan, ölü hücreler kırmızı floresan vermekte ve sayıları belirlenmektedir. Canlı hücreler ise, çok az floresan gösterirler veya hiç floresan göstermezler.

Tali testi için, HT-29 kolon kanseri hücreleri 25 cm2_{’lik flasklara ekildi. Kullanılan}

kitte belirlenen protokole göre, aşağıdaki basamaklar uygulandı.

1. Uygulama süresinin bitiminde hücreler tripsinle muamele edilip, flaskın tabanından uzaklaştırıldı.

2. Tripsinli hücreler, ependorf tüplere alınarak 700 g’de 2 dakika santrifüj edildi ve santrifüj sonunda üstteki süpernatant uzaklaştırıldı.

3. Üstteki süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, 200 µl 1X’lik Annexin Binding Buffer ve 10 µl Annexin V Alexa Flour eklenerek vortekslendi ve 20 dakika karanlıkta inkübasyona bırakıldı.

4. 750 g’de 2 dk santrifüj edildi ve üstte kalan kısım uzaklaştırıldı. 5. 100 µl 1X Annexin Binding Buffer eklendi.

6. Ardından bu karışıma 1 µl PI eklenerek, karışım karanlık ortamda 5 dk inkübasyona bırakıldı.

7. İnkübasyon sonrasında tüpler içerisindeki karışımdan 25 µl alınarak, Tali için hazırlanan özel lamlara pipetlendi ve Tali apoptoz analiz programı ile sonuçlar görüntülendi.

RNA izolasyonu

Hücreler flasklardan, 24’lük plakalara aktarıldı. 24 saat inkübasyonun ardından, plakalardan ilaçlı besiyeri tamamen uzaklaştırıldı ve plakalara taze besiyeri eklendi. 72 saat

33

inkübasyon sonrasında, kuyucuklardaki besiyeri çekildi. Hücrelerin plakalardan kaldırılması işlemi, lysis tamponu (lysis tamponu+β-merkaptoetanol) ile yapıldı. 24’lük plakalardaki hücrelere lysis tamponu eklendi ve hücreler kaldırıldıktan sonra tüplere konuldu.

Çalışmada; kontrol grubu ve kullandığımız ilaçlar olan 5-FU, Oxaliplatin ve Cetuximab’ın ABS ile kombinasyonları olacak şekilde 4 grup uygulandı.

Kültüre edilmiş hücrelerden RNA eldesi, PureLink® _{RNA Mini Kit kullanılarak yapıldı.}

İşlem, kit üreticisi firmanın kullanım kılavuzunda gösterdiği aşağıdaki basamaklar izlenerek yapıldı.

1. Hücrelerin kaldırılması işlemi, lysis tamponu (lysis tamponu+β-merkaptoetanol) ile yapıldı. Hücreler kaldırıldıktan sonra tüplere konuldu.

2. Ardından (1:1) oranında, %70’lik etanol konuldu. 3. İyice vortekslendi.

4. Karışım filtreli tüpe alındı.

5. Oda sıcaklığında 12000 g’de 20 sn santrifüjlendi. 6. Filtreli kısım başka bir tüpe alındı.

7. 700 µl yıkama tamponu I (Wash buffer I) eklendi. 8. Oda sıcaklığında, 12000 g’de 15 sn santrifüj edildi. 9. Filtreli kısım başka bir tüpe alındı.

10. Filtrenin üzerine, 500 µl yıkama tamponu II (Wash buffer II) eklendi. 11. Oda sıcaklığında, 12000 g’de 15 sn santrifüj edildi.

12. Alttaki kısım döküldü ve filtrenin üzerine tekrardan 500 µl yıkama tamponu II (Wash buffer II) eklendi.

13. Oda sıcaklığında 12000 g’de 2.30 dk santrifüjlendi. 14. Filtreli kısım 1.5 ml’lik ependorf tüplerine alındı. 15. 50 µl RNAaz free water eklendi.

16. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübasyona bırakıldı.

17. Oda sıcaklığında maksimum hızda 2 dakika santrifüjlendi.

18. Filtre çıkarılarak atıldı ve elde edilen RNA’ların konsantrasyonu ve saflığı nanodrop spektrofotometre kullanılarak ölçüldü ve sonuçlar ng/µl cinsinden bulundu.

34

cDNA sentezi

Primer olarak random hekzamerler kullanılarak, High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ile total RNA’dan cDNA sentezi yapıldı. cDNA sentezi sırasında kullanılan malzemeler ve miktarları aşağıda belirtilmiştir (Tablo 9).

Her bir örnek için; 10 mikrolitre RNA+H2O

10 mikrolitre cDNA mix olmak üzere, toplamda 20 µl karışım hazırlandı.

Tablo 9. cDNA mix için hazırlanması gereken maddeler

Her bir örnek için 0.2 ml’lik PCR tüplerine RNA + H2O (10 µl) ve cDNA mix (10 µl)

eklendi ve pipetaj yapıldı. Her bir örneğin final hacimleri 20 μl’ye tamamlandı. Tüpler Thermal Cycler’a yerleştirildi ve ardından hazırlanan cDNA reaksiyonu aşağıdaki programa göre çalıştırıldı (Tablo 10).

Tablo 10. Thermal Cycler cihazında uygulanan program

Sıcaklık Zaman Döngü Sayısı

Primer Bağlanması 25o_{C 10 dakika 1}

Ters transkripsiyon 37 oC 120 dakika 1

İnaktivasyon 85 oC 5 dakika 1

Soğutma 4oC - 1

Elde edilen cDNA örnekleri, RT-PCR’da kullanılıncaya kadar -20°C’de saklandı. cDNA mix 10X RT Buffer 2 µl 25X dNTPmix 0,8 µl 10X RT Random Primer 2 µl Reverse Transkriptaz 1 µl Nükleaz free su 4,2 µl

35

RT-PCR protokolü

Hazırlanan cDNA'larla birlikte, gen ekspresyon analizi için yeni bir karışım hazırlandı (Tablo 11). Bu karışım son hacim 13 µl olacak şekilde, 384 kuyucuklu plakaya aktarıldı. Apoptoz ile ilgili 6 genin ekspresyonu çalışıldı (Tablo 12). House keeping gen olarak, GAPDH kullanıldı.

Tablo 11. RT PCR karışımında bulunan maddeler

SYBR Green PCR Master Mix 7 µl

cDNA 2 µl

RNAaz-free water 3 µl

Primer F: 0,5 µl

R: 0,5 µl

Toplam 13 µl

Tablo 12. Çalışmada kullanılan primerler

Primer adı Forward Primer Reverse Primer

p53 5′-CACGAGCGCTGCTCAGATAGC-3′ 5′-ACAGGCACAAACACGCACAAA-3′

Sitokrom c 5′-AGTGGCTAGAGTGGTCATTCATTTACA-3′ 5′-TCATGATCTGAATTCTGGTGTATGAGA-3′ Apaf-1 5′-GATATGGAATGTCTCAGATGGCC-3′ 5′-GGTCTGTGAGGACTCCCCA-3′

Bax 5′-TTCATCCAGGATCGAGCAGA-3′ 5′-GCAAAGTAGAAGGCAACG-3′ Bcl-2 5′- ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA -3′ 5′- ACAGTTCCACAAAGGCATCC-3′ Kaspaz-3 5′-GGTATTGAGACAGACAGTGG-3′ 5′- CATGGGATCTGTTTCTTTGC-3′

Toplam 13 μl RT-PCR reaksiyonu, aşağıdaki koşullarda gerçekleştirilmiştir.

50.0 ºC’de 2 dk , 95.0 ºC’de 10 dk (1 Döngü) 95.0 ºC’de 15 sn, 60 ºC ’de 1 dk (40 Döngü)

36

İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME

Çalışmamızda elde edilen verilerin istatistiksel analizleri JMP istatistik programı kullanılarak yapıldı. Deneylerde elde edilen sonuçlar, ortalama ± SD olarak ifade edildi.

Kullanılan uygulamalara ait LD50 değerleri, ilaçların ferdi MTT değerlerinden Probit

analizi ile elde edildi. Deneylerde kullanılan ilaçların antagonistik ve sinerjistik etkileri, CompuSyn (version 1.0) programı kullanılarak incelendi.

CompuSyn programına göre, iki molekülün kombine etkilerini değerlendirmek için dikkate alınacak CI değerleri aşağıdaki gibidir (Tablo 13).

Tablo 13. CI değerleri değerlendirme tablosu

CI değerleri Kombine sitotoksik etki 0.1< Çok kuvvetli sinerjizm

0.1 – 0.3 Kuvvetli sinerjizm

0.3- 0.7 Sinerjizm

0.7-0.9 Hafif sinerjistik etki

0.9- 1.1 Additif etki

>1.1 Antagonizm

MTT deney sonuçlarından elde edilen verilerde gruplar arası farkın anlamlılığını değerlendirmede Student’s t testi kullanıldı.

RT-PCR gen ifadesi çalışmaları sonucu elde edilen veriler ise, Tukey-HSD testi kullanarak kıyaslandı. Sonuçlar, en az 3 paralel çalışmanın ortalaması ± standart hata olarak ifade edildi ve istatistiksel olarak anlamlılık değeri p<0.05 olarak kabul edildi.