Sol-jel bazlı enzim immobilizasyonu

Geleneksel silika bazlı sol-jel prosesi, sol olarak bilinen silikanın homojen bir süspansiyonunu oluşturmak için tetrametoksisilan (TMOS) ya da tetraetoksisilan (TEOS)

gibi bir alkoksitin asit ya da baz yardımı ile hidrolizini içerir. Oluşan sol daha sonra olgunlaştırma ve kurutma işlemine maruz bırakılır ve böylece daha fazla polikondenzasyon reaksiyonu ve çözücü uzaklaşması olur. Böylece polikondenzasyonla jel oluşumu gerçekleşir ve enzim jel içerisinde hapsedilir. Bu basamaklar Şekil 1.23.‟de özetlenmiştir.

RO Si OR OR OR 4 H₂O Si 4 ROH H+/OH- Si OR OR OR 3 H₂O Si 3 ROH H+_/OH- R' R' HO OH OH OH OH OH OH Si Si H+_/OH- HO OH O OH Si R' H₂O OH OH Si R' OH OH OH OH OH HO Si HO OH O OH Si R' OH OH H+_/OH- O Si O O Si R' O Si O O Si OH Si R' Si O O O Si R' O O O

A)

B)

C)

ġekil 1.23. Sol-jel matriksinin hazırlanması

Sahip olduğu pek çok özelliğinden dolayı sol-jel prosesi önemli bir immobilizasyon metodudur. Bunlar arasında:

(1) Yüzey alanı, tanecik büyüklüğü, morfoloji gibi kontrol edilebilir mikro yapı. Prekürsör tipi, katalizör tipi, prekürsörler oranı, su/prekürsör oranı, kurutma ve

olgunlaştırma prosedürleri gibi proses parametreleri değiştirilerek bu özellikler kontrol edilebilir.

(2) Mükemmel termal dayanıklılık, kimyasal inertlik, foto- ve elektro- kimyasal bozulmaya karşı direnç.

(3) Enzimin bütünlüğünü korumak için çözücü içerisinde sahip olunan mükemmel mekanik özellikler.

(4) Etkin kafeslemeden dolayı enzim ayrılmasının engellenmesi (Braun ve ark., 1990) sayılabilir.

İlk başarılı sol-jel bazlı enzim immobilizasyonu, 1990 yılında Avnir ve ark. tarafından alkali fosfatlar için kullanılmıştır. Enzimin katalitik aktivitesinin artmasında, hapsetmenin homojen olmasının ve sol-jelin mikro-çevresinin önemli olduğu bildirilmiştir. Enzimin aktivitesini kaybetmesi polipeptit zincirinin kapanması veya açılmasına bağlı olduğundan, bu çalışmada sıkı SiO2 kafesinin enzimin sağlamlığını arttığını

vurgulanmıştır. O zamandan bu yana enzimler, proteinler, antikorlar, antijenler, virüsler, bakteriler, hücreler gibi biyolojik olarak aktif türler ince filmler, monolitler, fiberler ve granüller halinde farklı seramik ve cam matrisler içerisinde sol-jel prosesi ile immobilize edilmektedir (Avnir ve ark., 1994; Avnir, 1995). İmmobilize enzimler heterojen biyokatalizör, biyosensörler vb. olarak kullanılmaktadırlar. Sol jel bazlı enzim immobilizasyonu alanındaki araştırmalar sol-jelin kimyasal bileşimi, katalizör tipi, su/silan oranı kurutma ve gelişme prosesi gibi pek çok yönü içerir. Bu proses parametreleri sol-jel matriksin yapısıyla yakından ilişkilidir. Bu ise immobilize enzimin kararlılığı ve aktivitesinin korunması ile ilgilidir.

1.4.1.4.1. Enzim immobilizasyonunda kullanılan sol-jel matriksinin kimyasal yapısı:

Silika sol-jeller için temel kimyasal yapı taşları TMOS ve / veya TEOS dur. Oluşan sol-jel, sert, inert ve porözlü olan saf SiO2 ağıdır. İnorganik ağın mekanik dayanıklılık

kazanması için termal işleme maruz bırakılması gerekir. Glikoz oksidaz (Chen ve ark., 1998) ve turp peroksidazı (Wei ve ark., 1999) gibi bazı enzimler TEOS ya da TMOS dan türemiş olan saf -(-SiO2-)-n matriksler içerisinde immobilize edildiği zaman iyi aktivite

gösterirler. Ancak lipazları da içeren pek çok enzim saf -(-SiO2-)-n matriks içinde

immobilize edildiği zaman iyi aktivite gösterememiştir. Bir biyolojik birim olarak enzimlerin, saf -(-SiO2-)-n matriksinin sağlayamadığı bir hidrofobik çevre içindeki

yardımcı prekürsörler olarak organik olarak modifiye edilen alkoksitlerin kullanılması, immobilize enzimlerin aktivitesinde iyileştirme sağlamıştır. Reetz ve ark., (1996), lipazların immobilizasyonu için TMOS ile birlikte yardımcı prekürsör olarak RSi(OCH3)3

gibi organik olarak modifiye olmuş alkoksitler veya 1,6-bis(trimetoksisilil)-hekzan kullanmışlardır. R olarak CH3, -C2H5, n-C3H7, n-C4H9, n-C18H37 kullanılmıştır. İmmobilize

lipazların kısmi aktivitesi alkil gruplarının zincir uzunluğu artıkça keskin bir şekilde arttığı belirlenmiştir (CH3<C2H5<n-C3H7<n-C4H9). Ancak R gruplarının büyüklüğündeki daha

fazla artış immobilize lipazın aktivitesinde sadece küçük bir artış sağlamaktadır. Ayrıca enzim immobilizasyonu için feniltrimetoksisilan (Wei ve ark., 1999), filosilikat (Hsu ve ark., 2002), 3-aminopropiltrietoksisilan (Venton ve Gudipati, 1995) and 3- glisidoksipropilltrimetoksisilan (Gill ve Ballesteros, 1996) gibi diğer organik olarak modifiye edilmiş alkoksitler yardımcı-polimerleştirici olarak TMOS ile birlikte kullanılmışlardır. Organik olarak modifiye edilmiş sol jeller içerisinde immobilize edilmiş enzimler saf-(-SiO2-)-n matriksi içinde immobilize edilmişlerden daha yüksek aktivite

göstermişlerdir. Bu sonuç organik yapı ile sağlanan bir hidrofobik mikro çevreye dayandırılmıştır.

Katalizörler, hidroliz ve kondenzasyon kinetiğini kontrol ederek sol-jel yapısını etkilerler (Hench, 1998). Hem asitler hem de bazlar silika silanların hidrolizinde ve kondenzasyonunda kullanılırlar. Alkoksi silanların hidroliz reaksiyonu silisyum atomu üzerindeki su oksijeninin nükleofilik atağı ile olur (Wright ve Sommerdijk, 2001). Hem hidroliz hem de kondenzasyon kimyasını açıklamak için kullanılan mekanizmalar nükleofilik sübstitüsyon ve katılma reaksiyonlarıdır. Bir asidik kataliz, hızlı hidroliz ve yavaş kondenzasyon ile sonuçlanır ve çapraz bağlı bir ağ meydana gelir. Bu ise düzgün olarak dağılmış küçük yarık şekilli ve dar porlara sahiptir (Ro ve Chung, 1991). Tersine bazik kataliz yavaş hidroliz ve hızlı kondenzasyon ile sonuçlanır. Hidroliz olan silanlara erişimin kısıtlılığından dolayı, pürüzlü silindirik ve eşit olmayan porlara sahip jel meydana gelir. Baz katalizli sol jeller normal olarak yüksek sıcaklıkta (örneğin 1000 o

C) bile dehidroksilat olmayan serbest –OH grupları bulundururlar (Asomoza ve ark., 1998).

1.4.1.4.2. Katkı maddesi-kontrollü enzim aktivitesi

Diğer immobilize enzim tiplerindeki gibi, hapsetme ile elde edilen pek çok immobilize enzimin aktivitesi de katkı maddelerine bağlıdır (Drevon ve Russell, 2002; Avnir ve ark., 1994; Ghanema ve Schurig, 2003; Shchipunova ve ark., 2004). Özellikle

sol-jel matriks içerisinde hapsedilen enzimler için bu durum daha önemlidir (Soares ve ark., 2004; Pandey ve ark., 1999). Enzim hapsetme prosesi esnasında ilave edilen katkı maddeleri genellikle aşağıdaki işlevlere sahiptir (Cao, 2005):

►Difüzyondan kaynaklanan sınırlamaları azaltma ►Gözenekliliği artırma

►Enzim aktivitesi üzerine etki

►Enzim konformasyonunu düzenleme

Bazı katkı maddeleri gözenekli matriks yapısının oluşumunu destekleyerek etkin difüzyon katsayısını artırabilirler. Sol-jel prosesinde pek çok bileşik katkı maddesi olarak kullanılabilmektedir. Bunlar arasında; taç eterler, kaliksarenler , polisakkaritler, yüzey aktif maddeler, metal tuzlar sayılabilir.