Serolojik Tanı

SBV için geliştirilen ve piyasaya sürülmüş olan ticari indirekt ELISA kitleri arasında ID Screen^® Schmallenberg virus Indirect Multi-species (ID.Vet, Fransa), IDEXX Schmallenberg Ab Test (IDEXX, ABD) ve SVANOVIR^® SBV-Ab (Svanova, İsveç) bulunmaktadır. Yarışmalı ELISA formatındaki ticari kit ise ID Screen^® Schmallenberg virus Competition Multi-species (ID.Vet, Fransa)’dir.

SBV’nin serolojik tanısı için serum, plasma, süt gibi numuneler kullanılmaktadır. Yapılan bir çalışmaya göre ticari ELISA kiti (Svanovir SBV-Ab, Svanova, İsveç) ile süt örneklerinin incelenmesi, serum örneklerinin incelenmesine göre daha iyi sonuç vermektedir. Altın standart test olan virüs nötralizasyon testi ile kıyaslandığında, pozitif prediktif değer süt ELISA için %98 iken serum ELISA için

%94 olarak; negatif prediktif değer ise süt ELISA için %100, serum ELISA için %50 olarak hesaplandığı rapor edilmiştir. Bu sonuçlara dayanarak araştırmacılar, ELISA için serum örneğinin kullanılmasının yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuç verme olasığı daha yüksek olduğunu iddia etmiştir (Daly ve ark. 2015).

SBV serolojik tanısı için virüs nötralizasyon testi ile ELISA testlerinin kıyaslaması, Avrupa’daki 7 farklı ülkedeki (Hollanda, Almanya, Fransa, İngiltere, Danimarka, İsveç, Belçika) 8 farklı laboratuvar tarafından aynı örneklerin bağımsız olarak test edilmesi ile yapılmıştır. SBV özgül antikor pozitif ve negatif koyun ve sığır serumları, sözkonusu laboratuvarlarda ayrı ayrı virüs nötralizasyon testi ve ticari ve/veya in-house ELISA kullanılarak analiz edilmiştir. Virüs nötralizasyon testi sonuçlarının laboratuvarlar arasında %100 uyumluluk gösterdiği bildirilmiştir.

ELISA sonuçları ise laboratuvarlar arasında yüksek oranda uyumluluk gösterse de şüpheli reaksiyonların pozitif olarak kabul edilmesi durumunda ELISA ile virüs nötralizasyon testlerinin arasında yüksek uyumluluk olacağı belirtilmiştir (van der Poel ve ark. 2014b).

Tam virüs partikülü temelli indirekt in-house ELISA testleri iki farklı araştırma grubu tarafından geliştirilmiştir (van der Heijden ve ark. 2013, Näslund ve ark. 2014). van der Heijden ve arkadaşlarının (2013) geliştirdiği testin virüs nötralizasyon testine göre sensitivitesi %98,8 olarak hesaplanmıştır (van der Heijden ve ark. 2013). Diğer çalışmada ise, virüs nötralizasyon testi ile kıyaslandığında geliştirilen ELISA testinin spesifitesinin %100 sensitivitesinin %99,19 olduğu bildirilmiştir (Näslund ve ark. 2014).

SBV tanısında kullanılmak üzere farklı virüs nötralizasyon testleri geliştirilmiştir. Bunlardan birisi, Vero hücresi kullanılarak 96 kuyucuklu hücre kültür pleytinde yapılan ve değerlendirilmesinde amido siyah (amido black) boyası

kullanılarak makroskobik olarak sitopatik etkiyi değerlendirmeye dayalı olan virüs nötralizasyon testidir. Bu testin hem sığır hem koyun örnekleri için yüksek spesifiteye ve sensitiviteye sahip olduğu bildirilmiştir (Loeffen ve ark. 2012). SBV için geliştirilen bir diğer virüs nötralizasyon testi ise plak redüksiyon nötralizasyon testidir. Bu testin yapılmasından önce plak titrasyon ile virüsün titresi belirlenmektedir. Ardından virüs-serum dilüsyonu karışımları 12 kuyucuklu hücre kültür pleytindeki Vero hücrelerine inokule edilip karboksimetil selüloz overlay ile 6 gün inkübasyon sonrasında kristal viyole ile plaklar görünür hale getirilmektedir (Mansfield ve ark. 2013).

Rekombinant SBV nükleoproteini E. coli’de açıklatılıp ticari indirekt ELISA kitinde (ID.Vet, Fransa) antijen olarak kullanılarak optimize edilmiştir. Geliştirilen nükleoprotein temelli ELISA virüs nötralizasyon testi ile kıyaslandığında aralarında

%98,9 oranında uyumluluk olduğu bildirilmiştir (Bréard ve ark. 2013). Rekombinant SBV nükleoproteini ayrıca Saccharomyces cerevisiae’da da açıklatılmış ve ELISA’da antijen olarak kullanılmıştır. Bu ELISA testi, yine nükleoprotein temelli olan ticari indirekt ELISA kiti (ID.Vet, Fransa) ile kıyaslandığında sensitivitesi %95, spesifitesi %93 olarak bulunmuştur (Lazutka ve ark. 2014).

SBV enfeksiyonunun ELISA ile teşhisinde süt ve tükürük numunelerinin de kullanılabileceği ELISA çeşitleri araştırmacılar tarafından geliştirilmiştir. Geliştirilen ELISA testlerinin sonuçları ticari ELISA kiti (ID.Vet, Fransa) ile kıyaslandığında, süt IgG ELISA testinin sensitivitesi %94, tükürük IgG ELISA testinin sensitivitesi

%85 ve tükürük IgA ELISA testinin sesitivitesi %98 olarak bulunmuştur (Lazutka ve ark. 2015). Bu bakımdan tükürük örneğinin de SBV enfeksiyonu teşhisinde gönderilebileceği bilgisi paylaşılmıştır.

SBV için immunofloresan testi BHK-21 (Bréard ve ark. 2013), Vero E6 (Endalew ve ark. 2018) ve Vero (Zhang ve ark. 2017) hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir. İmmunofloresan testi pek çok araştırmacı tarafından da kullanılmıştır (Wernike ve ark. 2013a, Kraatz ve ark. 2015, Zhang ve ark. 2015, Wernike ve ark.

2015).

SBV nükleoproteinine karşı pek çok araştırmacı tarafından monoklonal antikorlar üretilmiştir (Zhang ve ark. 2013, Lazutka ve ark. 2014). Bu antikorların üretiminde antijen olarak kullanılan SBV nükleoproteini, Saccharomyces cerevisiae’da (Lazutka ve ark. 2014) veya E.coli’de (Zhang ve ark. 2013) açıklatılmıştır. SBV nükleoproteini haricinde pan-Simbu monoklonal antikoru (Simbu serogrubundaki virüsler için), pan-SBV monoklonal antikoru (farklı SBV izolatlarının tamamı için) ve SBV izolat-özgül monoklonal antikorları da araştırmacılar tarafından geliştirilmiştir (Wernike ve ark. 2015).

SBV nükleoproteini üreten stabil BHK-21 hücre hattı rekombinant lentivirüs vektör sistemi kullanılarak oluşturulmuş ve bu hücre hattının immunofloresan testlerde, hücrelerden elde edilen nükleoproteinin de ELISA ve vestern blotlamada kullanılabileceği araştırmacılar tarafından gösterilmiştir (Zhang ve ark. 2015).

Benzer şekilde SBV nükleoproteini üreten stabil Vero hücre hattı da üretilmiş ve bu hücreler hem monoklonal hem de poliklonal anti-SBV serumları ile immunofloresan testinde başarıyla kullanılabilmiştir (Zhang ve ark. 2017). Bu hücre hatlarının, rekombinant SBV nükleoproteini üretiminde sürdürülebilir sistemler olarak kullanılabileceği araştırmacılar tarafından öne sürülmüştür.

Bir çalışmada, SBV enfeksiyonunun sürüdeki düşük seroprevalans ve yüksek prevalans senaryolarındaki örneklem sayıları koyun popülasyonu için teorik olarak hesaplanıp, nötralizasyon testi, ID.Vet ELISA ve IDEXX ELISA kitlerinin farklı seroprevalanslardaki performansları kıyaslanmıştır. Bu çalışmaya göre; düşük seroprevalansa sahip popülasyonlarda nötralizasyon testi ve ID.Vet ELISA’nın sürüdeki enfeksiyonu teşhiste başarılı olduğu bildirilmiştir. Çalışma sonuçlarına göre IDEXX ELISA ise sadece yüksek seroprevalansa sahip popülasyonlarda teşhiste başarılı olduğu ortaya konulmuştur. Nötralizasyon testi ile tanı için seroprevalans %1 iken 155 hayvandan, %5 iken 51 hayvandan ve %10 iken 27 hayvandan örnekleme yapılmasına ihtiyaç duyulduğu bildirilmiştir. Toplanması gereken örnek sayısı ID.Vet ELISA için; seroprevalans %1 iken 163 hayvan, %5 iken 54 hayvan ve %10 iken 28 hayvan olarak rapor edilmiştir. IDEXX ELISA kitinin ise düşük seroprevalans senaryolarından %1 ve %5’te sürüdeki seropozitifliği belirleyemediği,

%10 seroprevalansta seropozitifliği belirleyebilmesi için ise 85 hayvanın örneklenmesine ihtiyaç duyulduğu bildirilmiştir (Pejaković ve ark. 2018).