Sayısal Tasarım, Sayısallaştırılmış Tasarım

Na tentativa de obtermos a toxina Tx3-4 marcada isotopicamente para análises estruturais por espectroscopia de ressonância magnética nuclear, nós tentamos padronizar a expressão da toxina Tx3-4 no vetor pE-SUMO em bactéria E. coli ORIGAMI. A expressão foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida seguida por coloração pelo reagente RAPIDstain. A figura 41a corresponde ao gel da expressão e não foi possível visualizar a banda da proteína recombinante na faixa de massa molecular esperada (26 kDa). Para termos certeza se a toxina estava sendo expressa nós fizemos um western blot e utilizamos como controle a expressão da Tx3-4SUMO em ORIGAMI em meio LB (Figura 41b). Nós podemos observar que anticorpos anti-veneno total da P. nigriventer reconheceram a banda de expressão apenas na amostra de expressão em LB indicando que a toxina não estava sendo expressa em meio restritivo M9. Nós tentamos diferentes condições de expressão alterando a temperatura, DO de indução, troca de meio gradual e concentração de IPTG e em nenhuma tentativa nós conseguimos expressar a Tx3- 4SUMO em ORIGAMI em meio M9 (dados não mostrados). Nós resolvemos testar ao mesmo tempo a expressão da Tx3-4SUMO em E. coli BL21 (DE3) em meio M9 e meio LB e fizemos um western blot comparando com a expressão em ambos os meios utilizando a bactéria ORIGAMI. Na figura 41c, nós podemos observar que a toxina não foi expressa apenas na bactéria ORIGAMI em meio M9, mostrando uma incompatibilidade na expressão da toxina Tx3-4SUMO utilizando-se esta bactéria e o meio restritivo M9. Apesar de a toxina ter sido expressa em M9 utilizando-se a bactéria BL21 (DE3), nós não pudemos utilizá-la para análises estruturais porque a toxina expressa nesta linhagem de bactéria não é funcional e melhores condições de renaturação devem ser obtidas para a obtenção de quantidades suficientes de toxina para RMN.

Figura 41: Expressão da toxina Tx3-4SUMO em meio restritivo M9. a) SDS-PAGE 4-20% da expressão da toxina Tx3-4SUMO em ORIGAMI em M9. PM:Marcador de peso molecular Dual color Precision Plus. Coluna 1: Controle antes da indução da expressão com IPTG. Coluna 2: Após indução com IPTG. b) Imunoblot comparando a expressão da toxina Tx3-4SUMO (ORIGAMI) em meio M9 e LB. PM: Marcador de peso molecular Dual color Precision Plus. Coluna 1: Pré-indução em meio M9. Coluna 2: pós-indução em meio M9. Coluna 3: Pré-indução em meio LB. Coluna 4: pós-indução em meio LB. Coluna 5: Veneno total. c) Imunoblot comparando a expressão da toxina Tx3- 4SUMO em bácterias ORIGAMI e BL21 (DE3) e em meios M9 e LB. Coluna 1: Pré-indução em BL21 (DE3) / LB. Coluna 2: Pós-indução em BL21 (DE3) / LB. Coluna 3: Pré-indução em BL21 (DE3) / M9. Coluna 4: Pós-indução em BL21 (DE3) / M9. Coluna 5: Pré-indução em ORIGAMI / LB. Coluna 6: Pós-indução em ORIGAMI / LB. Coluna 7: Pré-indução em ORIGAMI /M9. Coluna 8: Pós-indução em ORIGAMI / M9. Anticorpo: anti-veneno total de P. nigriventer (1:1250). A revelação da membrana foi realizada utilizando-se o ECL Western Blotting Substrate (Pierce).

5 DISCUSSÃO

Toxinas do veneno da aranha Phoneutria nigriventer despertaram um grande interesse científico nas últimas décadas devido ao seu potencial farmacológico. As toxinas Tx3-6 e Tx3-4, isoladas da fração PhTx3, são potentes bloqueadoras de canais de cálcio sensíveis a voltagem, principalmente dos tipos N, P/Q e R (Prado, Guatimosim et al. 1996; Guatimosim, Romano-Silva et al. 1997; Vieira, Kushmerick et al. 2005). Devido a sua ação de inibição do influxo de cálcio e bloqueio da liberação do neurotransmissor glutamato, estas toxinas foram testadas como potenciais agentes teraupêuticos no tratamento da dor e na neuroproteção. A Tx3-6 apresentou um efeito analgésico em modelos de dor aguda e persistente, enquanto a Tx3-4 se mostrou eficaz prevenindo a morte celular após lesão isquêmica em fatias de hipocampo (Souza, Ferreira et al. 2008; Pinheiro, da Silva et al. 2009).

A obtenção destes peptídeos diretamente do veneno é um processo caro, dispendioso e pouco produtivo. Segundo Cordeiro e colaboradores (1993), partindo- se de 678 mg de veneno, o rendimento de purificação das toxinas após fase reversa e troca iônica (HPLC) foi de 683 μg para a Tx3-6 e de 665 μg para a Tx3-4. Como cada aranha produz em torno de 1,25 mg de veneno por extração (Lucas 1988), para a obtenção de 1 mg de cada uma das toxinas, seria necessário extrair o veneno de mais de 1.000 aranhas.

Essa dificuldade em se obter grandes quantidades destes peptídeos é um grande obstáculo na continuidade de testes farmacológicos e estruturais que levariam ao desenvolvimento de novas drogas. O avanço da tecnologia do DNA recombinante nas últimas décadas tornou possível a produção de proteínas em grandes quantidades. A clonagem gênica em vetores de expressão possibilita a inserção de genes exógenos em células de bactérias, leveduras, insetos e mamíferos, fazendo com que estes organismos produzam proteínas de interesse em quantidades praticamente ilimitadas (Alberts 2002; Brown 2003).

Este trabalho teve, portanto, o objetivo de estabelecer as melhores condições para obtenção de grandes quantidades das toxinas Tx3-6 e Tx3-4 funcionais através da expressão destas toxinas recombinantes em sistemas heterólogos.

5.1 Expressão em Pichia pastoris (vetor pPICZ)

O primeiro hospedeiro utilizado na tentativa de obtermos a toxina Tx3-6 funcional foi a levedura Pichia pastoris. A nossa escolha se deveu ao fato de a Pichia, por se tratar de um organismo eucarioto, apresentar algumas vantagens em relação à utilização de bactérias como hospedeiro como, por exemplo, a disponibilidade de um ambiente mais propício a modificações pós-traducionais, que incluem enovelamento, glicosilação e metilação (Li, Anumanthan et al. 2007). O vetor pPICZ possui o promotor PAOX1, que regula a produção da enzima álcool

oxidase, responsável por guiar a expressão da proteína heteróloga em Pichia. Este vetor havia sido utilizado com sucesso na superexpressão de algumas toxinas de aranha, como a toxina GsMTx4 da tarântula Grammostola spatulata (Park, Kim et al. 2008) e a Huwentoxina 1 da aranha Selenocosmia Huwena (Nie, Li et al. 2002). Estas toxinas, quando expressas em Pichia usando o vetor pPICZ, mostraram-se funcionais e tiveram um alto rendimento (>80 mg/L). Uma grande vantagem do vetor pPICZ é a expressão da proteína recombinante em fusão com uma cauda de aminoácidos histidina, que favorece a purificação da proteína produzida por afinidade em resina de Ni2+.

O rendimento obtido para a expressão da toxina Tx3-6 recombinante em Pichia foi muito baixo, sendo que a quantidade de toxina obtida após a expressão em 3 litros de cultura foi tão pequena que só pôde ser detectada através de western blot. Uma das possíveis razões para a baixa expressão da toxina Tx3-6 é o fato de não termos utilizado os códons preferenciais da P. pastoris durante a clonagem do cDNA. A expressão do domínio F2 do antígeno ligador de eritrócitos (EBA-175) de P. falciparum em Pichia não foi detectada quando utilizaram os códons nativos da proteína e a alteração para os códons preferenciais de Pichia rendeu uma expressão de 250 mg/L de cultura (Yadava and Ockenhouse 2003). Uma outra possibilidade para o baixo rendimento seria a presença de proteases ativas que degradam proteínas estranhas em leveduras, sendo esta, uma grande desvantagem deste sistema (Daly and Hearn 2005). Algumas linhagens de leveduras livres de proteases já estão disponíveis comercialmente, porém, são menos viáveis, crescem mais devagar e são mais difíceis de se transformar (Cereghino and Cregg 2000).

Apesar do citoplasma de hospedeiros procariotos não apresentarem as melhores condições para modificações pós-traducionais, inúmeras proteínas