DPPH ve ABTS Radikal Söndürme Aktivites

DPPH kararlı serbest radikali antioksidan aktiviteyi belirlemek için substrat olarak kullanılan bir bileşiktir. DPPH radikalleri azotun kararsız yapısından dolayı hidrojen atomunu kolaylıkla kabul eder (Şekil 5.1.1). Antioksidan bileşiklerde bulunan zayıf X-H bağının kırılıp hidrojen atomunun DPPH tarafından kabul edilmesiyle mor renk şiddetinde bir azalma görülür ve bu azalmadan antioksidan aktivite ölçülür (Şekil 5.1.2) (Amarowicz ve ark. 2004, Kim, Matsushita ve ark. 2014).

127

Şekil 5.1.1. Kararlı serbest radikal DPPH yapısı (Ionita 2005)

Şekil 5.1.2. DPPH molekülünün serbest radikal X ile tepkimesi, ana ürün NO2-DPPH-H’dır

(Ionita 2005)

Radikal söndürme aktiviteleri serbest radikallerin biyolojik sistemler ve gıdalardaki zararlı etkilerinden dolayı önemlidir. Serbest radikallerin aşırı oluşumu gıdalarda lipid oksidasyonunu hızlandırır ve gıda kalitesini düşürür. Yaptığımız bu çalışmada karpuz suyu (5-150 µl/ml), liyofilizat (5-150 µg/ml) ve pozitif kontrollerin (BHA, BHT) (5-150µg/ml) artan derişimlerine bağlı olarak DPPH radikalini söndürme

128

aktiviteleri test edildi. Konsantrasyon artışına bağlı olarak % inhibisyon değerlerinin de yükseldiği gözlendi. Çalışılan en yüksek konsantrasyon olan 150 µl/ml ve 150 µg/ml’de karpuz suyu %43.965 ± 0.68 inhibisyon gösterirken liyofilizat %57.333 ± 5.56 inhibisyon gösterdi. Diğer taraftan, BHA ve BHT sırasıyla %89.818 ± 2.61 ve %89.547 ± 1.63 inhibisyon gösterdi. BHA ve BHT için istatistiksel olarak birbirine benzer radikal söndürme aktivitesi ölçüldü. Karpuz suyu ve liyofilizat için tespit edilen aktiviteleri istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermektedir (p ≤ 0.05). Ayrıca, BHA ve BHT ile karpuz suyu veya liyofilizatın aktiviteleri arasında anlamlı farklılık mevcuttur (Tablo 4.1.2, Şekil 4.1.2).

DPPH deneyinde, karpuz suyu ve liyofilizat serbest radikal DPPH’yı sarı renkli difenil pikrildihrazin kararlı radikaline dönüştürdü. Bu metotda hidrojen donörü antioksidanlar varlığında metanolde hazırlanan DPPH çözeltisinin indirgenmesine bağlı olarak radikal olmayan DPPH-H formu oluştu. Karpuz suyu ve liyofilizatın antiradikal aktivitesi DPPH radikalinin 517 nm dalga boyundaki absorbansının düşmesinden hesaplandı.

Kim, Park ve ark. (2014) karpuz suyundan ekstrakte edilen likopenin % DPPH radikalini söndürme aktivitesi; konsantrasyonu %0.02 ve %0.04 olan çözeltilerde ölçülmüş, aktivitenin konsantrasyona bağlı olarak iki katına çıktığı tespit edilmiştir. Domatesten izole edilen ticari likopenin (pozitif kontrol) aktivitesi oldukça düşük ölçülmüştür.

Kim, Matsushita ve ark. (2014) yaptıkları çalışmada karpuzun % DPPH radikalini söndürme aktivitesini 100 µg/ml’de 10.80 ± 0.13 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada, artan sıcaklıklarda ısıl işlem gören numunelerde zamanla aktivitenin de yükseldiği gözlenmiştir. Bizim yaptığımız çalışmada ise, karpuz suyu 100 µl/ml’de %43.349 ± 1.74 ve liyofilizat 100 µg/ml’de %49.733 ± 2.27 inhibisyon gösterdi.

Yaptığımız bu çalışmada, karpuz suyu ve liyofilizatın test edilen konsantrasyonlarında % DPPH radikalini söndürme aktivitesinin yüksek olduğu gözlendi.

Antioksidan molekül veya herhangi bir indirgeyici etken X, 600-750 nm dalga boyunda güçlü absorbsiyon bandı bulunan karbon merkezli, renkli ve kararlı bir radikal

129

olan ABTS•+ ile etkileşir. Renk şiddetindeki azalma pozitif kontrol (troloks, askorbik asit, quercetin, BHT) ile karşılaştırılır (Amorati ve ark. 2013).

ABTS sistemi; birçok bitkisel özütte zincir kırıcı antioksidanların (lipid peroksil radikal söndürücüler) ve hidrojen verici antioksidanların (sulu faz radikal söndürücüler) radikal söndürme aktivitelerini ölçmede yaygın olarak kullanılmaktadır (Leong ve Shui 2002, Kim, Matsushita ve ark. 2014).

Karpuz suyu (5-100 µl/ml), liyofilizat (5-100 µg/ml) ve pozitif kontrollerin (troloks, askorbik asit, quercetin, BHT) (5-100 µg/ml) artan derişimlerine bağlı olarak % ABTS serbest radikal süpürme etkisi araştırıldı. Konsantrasyon artışına bağlı olarak % inhibisyon değerlerinin de yükseldiği gözlendi. Çalışılan en yüksek konsantrasyon olan 100 µl/ml’de karpuz suyu %90.008 ± 0.12 inhibisyon gösterirken 100 µg/ml’de liyofilizat %7.013 ± 1.58 inhibisyon gösterdi. Diğer taraftan, troloks, askorbik asit, quercetin ve BHT sırasıyla; %99.607 ± 0.44, %99.560 ± 0.32, %99.084 ± 0.87 ve %63.467 ± 12.56 inhibisyon gösterdi. Bu konsantrasyonda, pozitif kontroller ve karpuz suyu benzer inhibisyon etkisi gösterirken liyofilizat istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermektedir (p ≤ 0.05) (Tablo 4.1.3, Şekil 4.1.3).

Kim, Matsushita ve ark. (2014) yaptıkları çalışmada karpuzun % ABTS radikalini söndürme aktivitesini 100 µg/ml’de 15.09 ± 0.76 olarak tespit etmişlerdir. Ayrıca DPPH radikalinde olduğu gibi ABTS radikalini söndürme aktivitesinde de artan sıcaklıklarda ısıl işlem gören numunelerde zamanla aktivitenin de yükseldiği gözlenmiştir.

Leong ve Shui (2002) Singapur’daki marketlerde satılan bazı meyve posalarının ABTS serbest radikalini söndürme aktivitelerini araştırmaları sonucu karpuzun 100 gramının 11.9 ± 0.1 mg L-askorbik aside eşdeğer antioksidan kapasite gösterdiğini tespit etmişlerdir. Vijaya Kumar Reddy ve ark. (2010) ise Hindistan’da yaygın olarak yaş ve kuru tüketilen meyvelerin antioksidan aktivitelerini araştırmışlar; 100 gram taze karpuzun ABTS radikalini söndürme aktivitesi 23 ± 3.8 mg troloksa eşdeğer bulunmuştur.

Diyarbakır karpuzunun hem % DPPH hem de % ABTS radikalini söndürme aktivitesi Leong ve Shui (2002), Kim, Matsushita ve ark. (2014) ile Kim, Park ve ark. (2014)’n çalışmalarında elde edilen sonuçlardan daha yüksektir.

130 5.1.3. İndirgeme Gücü

İndirgeme gücü, Fe3+_{/ferrisiyanür kompleksinin antioksidan varlığında Fe}2+_’ye

indirgenmesine dayanmakta olup potansiyel antioksidan aktivitenin önemli bir göstergesidir (Meir ve ark. 1995).

Fe2+ veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu (Tepkime 11) sonucu hidroksil radikali (.OH) oluşumu katalizlenir.

Hidroksil radikalinin biyolojik sistemlerdeki tepkimeleri: a) Elektron transfer tepkimeleri,

b) Hidrojen çıkarma tepkimeleri (Hidroksil radikali organik moleküllerden hidrojen atomu alarak suya indirgenir),

c) Katılma tepkimeleridir (Pürin ve pirimidin bazları ile aromatik asitler gibi elektronca zengin moleküllerle gerçekleşir).

Bu tepkimeler, .OH’ın dış orbitalindeki ortaklanmamış elektronundan kaynaklanmaktadır.

Hidroksil radikali ile oluşan en iyi tanımlanmış biyolojik hasar, lipid peroksidasyonu olarak bilinen serbest radikal zincir reaksiyonudur. Ayrıca nükleik asitler ve proteinlerde de radikalik zincir tepkimelerine yol açar (Akkuş 1995).

İndirgeme gücü; farklı bitki örneklerinin önemli antioksidan aktivite göstergesidir. Bu aktiviteyi gösteren bileşikler elektron donörüdür ve lipid peroksidasyonu sürecinde oluşan oksitlenmiş ara ürünleri indirgeme kapasitesine sahiptir (Barbunsinski 2009).

Liyofilizat varlığında Fe+3’ü Fe+2’ye indirgeme gücü araştırıldı. BHA, BHT ve

α-tokoferol pozitif kontrol olarak kullanıldı. Liyofilizat, BHA, BHT ve α-tokoferolün

100 µg/ml konsantrasyonda indirgeme gücü sırasıyla; 0.058 ± 0.00, 0.723 ± 0.09, 0.553 ± 0.06 ve 0.690 ± 0.03 olarak ölçüldü. Bu çalışmada, sarı renkli test çözeltisi antioksidan numunelerin indirgeme gücüne bağlı olarak mavi ve yeşilin çeşitli tonlarına

131

dönüştü. Söz konusu 100 µg/ml konsantrasyonda, BHA ve BHT’nin gösterdiği indirgeme gücü seviyeleri arasında istatistiksel açıdan fark yok iken, aynı konsantrasyonda liyofilizat ve α-tokoferol arasında istatistiksel olarak bir fark bulunmuştur (p ≤ 0.05) (Tablo 4.1.4, Şekil 4.1.4).

Kim, Matsushita ve ark. (2014) yaptıkları çalışmada, 100 µg/ml’de karpuzun indirgeme gücü 0.003 ± 0.00 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada, ısıl işlem 200

o_{C üstüne çıkartıldığında artan süreye bağlı olarak indirgeme gücü yükselmiştir.}

Müller ve ark. (2011) karoten grubu içinde sadece likopenin etkili indirgen bir bileşik olduğunu açıklamışlardır. Ferrik indirgeme aktivitesinin büyük oranda konjuge çift bağ sisteminin boyutundan etkilendiği rapor edilmektedir. Likopenin indirgeme gücünü konjuge çift bağları aracılığıyla oluşan kararlı karotenoid radikal sağlar.

Bir bileşiğin indirgeme kapasitesi antioksidan antivitesinin önemli bir göstergesidir. Liyofilizatın indirgeme gücünün düşük olmasının çalışılan konsantrasyonlarda (50, 100 ve 250 µg/ml) çözeltide bulunan likopen içeriğinin düşük olmasından kaynaklandığını düşünmekteyiz.