Pirüvat

Pirüvat için grupların 1. gün, 7. Gün ve 14. Gün tanımlayıcı istatistikleri(ortalama, standart sapma, minimum ve maksimum değerleri).

Tablo 4.24. 1. gün grupların mikrodiyaliz ile pirüvat için tanımlayıcı bulgular Pirüvat 1. Gün Mikrodiyaliz Grup Değerleri mmol/l

Ortalama Standart Sapma Minimum-Maksimum

Grup 1 1,87 0,40 1,20-2,21

Grup 2 2,89 0,69 1,90-3,80

Grup 3 0,87 0,28 0,40-1,30

Gliserol 1. gün 7. gün 14. gün

Mann-Whitney U 20,000 16,000 24,000

P değeri ,208 ,093 ,401

38

Tablo 4.25. 7. gün grupların mikrodiyaliz ile pirüvat için tanımlayıcı bulgular Pirüvat 7. Gün Mikrodiyaliz Grup Değerleri mmol/l

Ortalama Standart Sapma Minimum-Maksimum

Grup 1 1,24 0,27 0,81-1,70

Grup 2 2,12 0,64 1,30-3,20

Grup 3 0,99 0,27 0,68-1,47

Tablo 4.26. 14. gün grupların mikrodiyaliz ile pirüvat için tanımlayıcı bulgular

Pirüvat 14. Gün Mikrodiyaliz Grup Değerleri mmol/l

Ortalama Standart Sapma Minimum-Maksimum

Grup 1 1,01 0,24 0,64-1,40

Grup 2 1,29 0,40 0,80-1,90

Grup 3 1,13 0,37 0,77-1,84

Tablo 4.27. Bonferoni Düzeltmeli Mann Whitney U testi ile Grup 2 ve Grup 3 Mikrodiyaliz Sonuçlarının Karşılaştırılması (P<0,05 alınmıştır)

Grup 2 ve Grup 3 arasında 1. Gün ve 7. gün pirüvat değerleri arasında anlamlı fark bulunmuştur.

Tablo 4.28. Bonferoni Düzeltmeli Mann Whitney U testi ile Grup 1 ve Grup 3 Mikrodiyaliz Sonuçlarının Karşılaştırılması (P<0,05 alınmıştır)

Grup 1 ve Grup 3 arasında 1. gün pirüvat değerleri arasında anlamlı fark bulunmuştur.

Pirüvat 1. gün 7. gün 14. gün

Mann-Whitney U ,000 1,000 24,500

P değeri ,001 ,001 ,431

Pirüvat 1. gün 7. gün 14. gün

Mann-Whitney U 1,500 15,500 28,000

P değeri ,001 ,083 ,674

Tablo 4.29. Bonferoni Düzeltmeli Mann Whitney U testi ile Grup 1 ve Grup 2Mikrodiyaliz Sonuçlarının Karşılaştırılması (P<0,05 alınmıştır)

Pirüvat 1. gün 7. gün 14. gün

Mann-Whitney U 5,000 5,500 18,500

P değeri ,005 ,005 ,156

Grup 1 ve Grup 2 arasında 1. gün ve 7. gün pirüvat değerleri arasında anlamlı fark bulunmuştur.

40 5. TARTIŞMA

Vücudun herhangi bir yerinde patolojik bir olay sonucuna cevap olarak başlayan yara iyileşmesi her nekadar tam olarak anlaşılamamış bir süreç olsadakompleks bir işlem olduğu ve bir çok büyüme faktörü ve mediyatör ile regüle edildiği bilinmektedir (37,66).

Yara iyileşmesi 3 fazdan meydana gelir. Çeşitli hücresel ve sistemik faktörler etkilidir. İlk aşama olan inflamasyon fazı hemostaz ile başlar, nekrotik dokuların, enfeksiyon etkenlerinin temizlenmesi amacı ile erken dönem nötrofil ve geç dönem makrofaj göçü ile devam eder.

Proliferatif evre: Yaklaşık 2 hafta sürecek oldukça selüler ve vasküler bir dönemdir (67).

Keratinositlerin yara kenarından başlayarak tüm yara yüzeyini örtecek şekilde göçü başlar.

Bu göçü başlatan sinyaller şunlar olabilir:

- yara matriksi

-trombositlerden salınan kemotaktik faktörler

- komşu hücreler arasındaki ‘’contactinhibition’’ mekanizmasının kaybı.

Yara kontraksiyonun başladığı dönem olan proliferasyon evresi aynı zamanda granulasyon dokusununda oluştuğu dönemdir. Granulasyon oluşumu 2 basamakta gerçekleşir.

1. Fibroplazi: Kısaca fibroblastların yara bölgesini doldurması ve kollajen ve ekstaselülermatriks sentezlemesi olarak açıklanabilir. Hücre sitoplazması periferinde yerleşmiş aktinflamanlarının oluşumu ile kasılabilme özelliği kazanmış fibroblastlar artık miyofibroblast olarak adlandırılır. Yara bölgesine ulaşmış fibroblastlar makrofajlardan salınan bazı büyüme faktörleri uyarısı ile prolifere olurlar (81).

2. Anjiogenezis: Yaralanmadan 2-3 gün sonra yara alanına yakın küçük venüllerden yeni damar tomurcukları oluşur. Anjiyogenezisi uyaran faktörler; makrofajlardan salınan TNF-alfa, IL8, trombositlerden salınan PDGF, TGF-beta, heparin, fibronektindir (82, 83).

Yeniden şekillenme evresi: Doku yaralanmasından sonraki 3. hafta başlayan remodelling dönemi aylar hatta yıllar boyunca devam eder. Granulasyon dokusunun yerini hücre ve damardan fakir skar dokusuna bırakması ile yeni skar dokusunun olgunlaşması ile devam eden süreçtir.

Bilindiği üzere plateletler yara iyileşmesinde ve doku onarımında etkili sitokinler ve büyüme faktörlerinin kaynağıdır (4,5).

Plateletten zengin plazma (PRP) hastanın kendi kanından hazırlanan ve periferik kandaki trombosit konsantrasyonunun çok üzerinde trombosit içeren plazma hacmidir. PRP otolog kanın santrifüj edilmesi ile elde edilir ve normalin 3-8 katı yoğun bir trombosit sayısına ulaşılabilir.

PRP yara iyileşmesini, içerdiği büyüme faktörleri ile hızlandırır. Bunlar platelet kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF), damar endotel büyüme faktörü (VEGF), dönüştürücü büyüme faktörüdür (TGF). Bu büyüme faktörleri mezenşimal hücre oluşumunu kontrolünde, çoğalmasında ve iyileşme sürecinde hücre dışı matriks sentezinde önemli rol oynarlar.

Elde edilmesi ile ilgili farklı metodlar tanımlanmıştır (68,69).

PRP preparasyonu, PRP araştırmalarının en kritik basamağı olarak ön plana çıkmaktadır (37, 68). Preparasyon sonrasında ortalama 0.5 ml PRP elde edilmektedir (68).

Tanımlanmış preparasyon teknikleri ile trombosit miktarı 4.1-6.5 kat arttırılabilmekte ve 450.000-800.000 arasında değişmektedir (93, 94). Ayrıca literatürde daha yüksek trombositdeğerlerinede ulaşıldığı görülmektedir. Buna karşın PRP’ nin biyolojik olarak aktif uygun konsantrasyonu halen tam olarak bilinmemektedir (73,95, 96).Çok yüksek trombosit değerlerinin inhibe edici etkisi olduğu öne sürülmekte bu nedenlede yüksek konsantrasyonlara ihtiyaç olmadığı belirtilmektedir (71, 73). Kendi çalışmamızda ulaştığımız trombosit değerlerinin istenen düzeyi yakaladığını gördük.

PRP’ nintrombin ve kalsiyum ile muamelesi sonucu trombositde granulasyonu gerçekleştiği ve büyüme faktörlerinin ortama salındığı belirtilmektedir (40, 73). PRP’ nin

42

içerdiği büyüme faktörlerinin miktarlarının kantitatif tayini güç olmakla birlikte (40) nmol miktardaki büyüme faktörlerinin etkili olduğu bilinmektedir.

PRP’ nin içerdiği mediyatörlerin etkinliklerinin süresi ve derecesi ile ilgili net bilgiler yoktur (37). Ancak PRP’ nin erken dönem rejenerasyonda belirgin etkilerinin olduğu öne sürülmektedir (69, 70, 71, 72). Yapmış olduğumuz çalışmada patolojik incelemelerde inflamasyon belirgin olmak üzere granulasyonda anlamlı farklar olduğunu gördük.

Ucuz ve otolog bir büyüme faktörü kaynağı olması (69) ve minimal invaziv kolay uygulama tekniği ile düşük enfeksiyon riski PRP kullanımına ilgiyi arttırmıştır. Non-toksik ve minimal yan etkiye sahiptir (40,97). Kullanmış olduğumuz preparasyon tekniği ile elde ettiğimiz trombosit düzeylerinin ortalama ve standart sapma değerleriliteratürde belirtilen düzeylerde idi ve klinik uygulamalarda rahatlıkla elde edilip kullanılabileceğini düşünmekteyiz.

Schlegen ve ark. Yaptıkları çalışmada ilk 2 hafta içerisinde yapılan PRP uygulamasının kemik iyileşmesi üzerine etkili olduğunu saptamışlardır (74).

Otolog yağ grefti yumuşak dokularda ideal dolgu maddesi olarak öne çıkmakta ve plastik cerrahide sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak öngörülemeyen resorpsiyon oranı nedeniyle yağ grefti uygulamalarında çekinceler vardır. Gentile ve arkadaşları (111) bu sorunu ortadan kaldırmak için ve yağ grefti yaşayabilirliğini artırmak için transplantasyon öncesinde alınmış yağ greftini PRP ile karıştırıp uygulamışlardır. Yaptıkları çalışma sonucunda PRP yardımlı yağ aktarımı ile sadece yağ aktarımı yapılan gruplar karşılaştırılmış, PRP yardımlı yağ aktarımı yapılan grupta 1 yıl sonucunda transplante edilen yağ grefti dokusunun %69 oranında korunduğunu göstermişlerdir. PRP uygulanmayan grupta ise bu oran %39’dur.

Zografou ve arkadaşları adipoz kaynaklı kök hücrenin diyabetik sıçanlarda tam kalınlıkta deri grefti üzerine etkilerini araştırmışlardır (112). Yaptıkları bu çalışmada defekti sırt bölgesinde 3x3 cm olacak şekilde planlamışlardır. Elde edilen kök hücre preparasyonunu, oluşturulan defekt altındaki fasya içine birkaç noktadan enjekte etmişlerdir. Çalışmalarında kök hücre uygulanan grupta ortalama nekroz alanı yüzdesini %7,49 kontrol grubunda ise

%39,67 olarak bulmuşlardır. Problemli ve kronik yaralarda, yara yönetimi optimal şartlarda dahi zorlu ve komplikasyonlara açık bir süreçtir.

Diyabetik yaralarda büyüme faktörü üretme ve kemotaktik faktör salgılama yeteneği normal dokulara göre oldukça azalmıştır. Yara iyileşmesi ve greftyaşayabilirliği üzerine yapılan birçok çalışmada yara iyileşme sürecini olumsuz etkileyen temel neden olarak büyüme faktörlerinin eksikliği ve etkinliklerindeki azalma gösterilmiştir. Zografou çalışmasında kök hücre kaynaklı büyüme faktörlerini ön plana çıkarırken biz çalışmamızda doku hasarında akut dönemde salgılanan trombosit kaynaklı büyüme faktörlerinin etkilerini değerlendirmeye çalıştık.

Özellikle akut cerrahi travmalarda ve kronik iyileşmeyen yara tedavisinde otolog kaynaklı PRP klinik tedavi alternatifi olarak birçok cerrahi branşta giderek popülarite kazanmaktadır (98-104). Giderek artan klinik kullanımı ve klinik etkilerine rağmen henüz etkinliği bilimsel olarak kanıtlanamamış olup, hastalarla ilgili elde edilen sonuçlar deneysel verilere dayanmaktadır (105).

Kronik yaraları iyileştirmek üzere yapılan çok sayıda girişim sistemik ve lokal doku büyüme faktör seviyesini artırmaya odaklanmıştır. Topikal EGF, PDGF ve TGF-β büyüme faktörlerini içeren uygulamalarda farklı sonuçlar elde edilmiştir (106-110).

Biz çalışmamızda PRP etkinliğini hem klinik hem de veri düzeyinde gösterebilmek amacıyla mikrodiyaliz tekniğini kullandık. Elde ettiğimiz sonuçlar doğrultusunda hem makroskobik hem de istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar ortaya koyduk.

Mikrodiyaliz hayvanlarda ve insanlarda çeşitli dokularda ara hücrelerarası endojenmediatörler, metabolitleri ve ilaç miktarlarını saptamak için yıllardır kullanılan bir yöntemdir (75).

Mikrodiyaliz minimal doku travması ile hücre dışı sıvıdan gelen bileşiklerin örnekleme sağlar (76).

Herşeyden önce amaç hücre metabolizmasının temel belirteçleri olarak laktat, piruvat, glikoz ve gliserol izlenmesidir (77).

44

Laktat / piruvat oranı sitoplazmik redoks durumunu yansıtır ve böylece doku oksijenasyonu hakkında bilgi sağlar. Bir yüksek laktatpiruvat oranı (> 40) sıklıkla serebralhipoksi veya iskemi bir işareti olarak yorumlanır (78).

Yaptığımız çalışmada bizde doku hasarlanması ve rejenerasyon aşamalarında interstisyumda glikoz, gliserol, laktat ve piruvat değerlerini inceledik. Elde ettiğimiz veriler gösterdiki PRP uygulaması yapılan grupta glikoz, laktat ve pirüvat değerlerinde anlamlı farklar vardı. Biz bu farklılığı PRP içeriğindeki büyüme faktörlerinin hücre metabolizması ve yara iyileşmesi üzerine olumlu etkileri olarak yorumladık.

Yara iyileşmesinin tam olarak anlaşılamamış karmaşık yapısı kemik iyileşmesi için de geçerlidir. Bu nedenle Förster ve arkadaşları yaptıkları çalışmada bu süreci daha net anlayabilmek için sıçan femurunda defekt oluşturup, defekt sonrası ilk 24 saatte mikrodiyaliz teknolojisini kullanarak sitokin ve büyüme faktörü konsantrasyonlarının ölçülebilirliğini araştırmışlardır. Çalışmalarında kemik yaralanmasının ilk saatlerinde mikrodiyaliz tekniği kullanılarak ölçülen sitokin değerlerinin yara iyileşmesinin ilk basamaklarını anlamada mükemmel bir yol gösterici olabileceğini ortaya koymuşlardır (114).

Oral alınan ilaçlar ve maddelerin farmakokinetikleri ve doku dağılımları, IV alınan maddelerinkine göre daha komplekstir. Schier ve arkadaşları yaptıkları çalışmada (115) sadece oral kullanılan etanolün beyin dokusundaki konsantrasyonunun davranış üzerine etkilerini mikrodiyaliz ile ölçerek değerlendirmişlerdir. Görüldüğü üzere gerek kemik dokuda gerekse beyin dokusunda yara iyileşmesi, ilaç farmakokinetikleri üzerine birçok mikrodiyaliz çalışması mevcuttur. Biz de çalışmamızda yumuşak dokuda yara iyileşmesini değerlendirmede mikrodiyaliz tekniğini kullanarak hücre metabolitlerini değerlendirilmesinin güvenli sonuçlar verdiğini düşünmekteyiz.

6.SONUÇ

Yapılan bu çalışmada defekt modeli oluşturulan sıçanlarda uygulanan FTSG yaşayabilirliliğinin ve yara iyileşmesi üzerine PRP etkilerinin mikrodiyaliz verileri ışığında histopatolojik ve istatiksel olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. PRP uygulanmış grupta hiç nekroz alanı izlenmemiş olup elde edilen veriler ile yapılan değerlendirme sonuçları göstermiştir ki aynı grupta mikrodiyaliz sonuçlarının istatiksel analizinde anlamlı farklar ortaya çıkmıştır ve yine bu sonuçlar ile birlikte histopatolojik veriler karşılaştırıldığında PRP’ nin yara iyileşmesi üzerine pozitif etkileri olduğu görülmüştür.

46 7. KAYNAKLAR

1. Lazarus GS, Cooper DM, Knighton DR, et al. Definitions and guidelines for assesment of wounds and evaluation of healing. Arch Dermatol 1994; 130: 489-493.

2. Calvin M. Cutaneous wound repair. Wounds 1998;10(1):12-32.

3. Clark RAF. Wound repair; overview and general considerations. In: Clark RAF (ed).The Molecular and CellularBiology of Wound Repair, Second Edition. London, UK, Plenum Press, 1996, pp3-50.

4. Simpson DM, Ross R. The neutrophilic leukocyte in wound repair: a study with antineutrophil serum. J Clin Invest.1972; 51: 2009-2023.

5. Marder SR, Chenoweth DE, Goldstein IM, et al. Chemotactic responses of human peripheral blood monocytes to the complement-derived peptides C5a and C5a des Arg. J Immunol 1985;134:3325-3331.

6. Clark RAF. Cutaneous wound repair. In: Goldsmith LE (ed).Biochemistry and Physiology of the Skin. Oxford, UK; Oxford University Press,1990: 576-601.

7. Leibovich SJ, Ross R. The role of the macrophage in wound repair: a study with hidrocortisone and antimacrophage serum. Am J Pathol.1992; 78: 71-100.

8. Park JE, Barbul A. Understanding the role of immune regulation in wound healing. Am J Surg. 2004; 187: 11-16.

9. Woodley DT. Reepithelialisation. In: Clark RAF (ed).The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, Second Edition. London, UK, Plenum Press 1996: 339-354.

10. Kirsner RS, Eaglstein WH. The wound healing process. Dermatologic Clinics 1993;11:629-640.

11. Kubo M, Norris DA, Howell SA, et al. Human keratinocytes synthesise, secrete and deposit fibronectin in the pericellular matrix. J Invest Dermatol 1984; 82: 580-586.

12. Wikner NE, Persichitte KA, Baskin JB, et al. Transforming growth factor beta stimulates the expression of fibronectin by human keratinocytes. J Invest Dermatol 1988;

91: 207-212.

13. Heinmark RL, Schwartz SM. The role of cell-cell interaction in the regulation of endothelial cell growth. In: Clark RAF, Henson PM (eds). The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. London, UK, Plenum Press, 1988: 359-371.

14. Werner S, Peters KG, Longaker MT, et al. Large induction of keratinocyte growth factor in the dermiş during wound healing. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 6896-6900.

15. Krane JF, Murphy DP, Carter DM, et al. Synergistic effects of epidermal growth factor and insülin like growth factor 1/somatemedin C on keratinocyte proliferation may be mediated by IGF 1 transmodulationof the EGF receptor. J Invest Dermatol 1991;96:419-424.

16. Clark RAF: Basics of cutaneous wound repair.J Dermatol Surg Oncol 1993;19:693-706.

17. Alison MR. Repair and regenerative responses. In McGee J, Isaacson PG, Wright NA, et al.(eds). Oxford Textbook of Pathology; Volume 1 Principles of Pathology. Oxford, UK, Oxford University Press 1992: 365-388.

18. Findlay JK. Angiogenesis in reproductive tissues. J Endocr 1986;111:357-366.

19. Welch MP, Odland GF, Clark RAF. Temporal relationships of F-actin bandle formation, collagen and fibronectin matrix assembly, and fibronectin receptor expression in wound contraction. J Cell Biol 1990;110:133-145.

20. Seinor RM, Griffin GL, Perez HD, et al. Human C5a and C5a des arg exhibit chemotactic activity for fibroblasts. J Immunol 1988;141:3570-3574.

48

21. Mustoe TA, Porras-Reyes BH: Modulation of wound healing response in chronic irradiated tissues, Clinics in Plastic Surgery, 1993; 20: 465-472.

22. Dielgelmann R. F., Cohen I.K., McCoy B.J. Growth kinetics and collagen synthesis of normal skin, normal scar and keloid fibroblasts in vitro. J Cell Physiol 1979; 98: 341.

23. Pietrzak WS, Eppley BL. Platelet rich plasma: Biology and new technology. J Craniofac Surg 2005;16:1043-1054.

24. Eppley BL, Pietrzak BS, Blanton M. Platelet rich plasma. A review of biology and applications in plastic surgery. Plast Reconstr Surg 2006;118(6):147e-159e.

25. Junquera LC., Carneiro J., Kelley RO., Blood cell, Basic Histology. Appleton, Lange 1992:294-295.

26. Weibrich G, Hansen T, Kleis W, et al. Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration. Bone 2004; 34: 665-671

27. Na JI, Choi JW, Choi HR, Jeong JB, Park KC, Youn SW, Huh, CH. Rapid healing and reduced erythema after ablative fractional carbon dioxide laser resurfacing combined with the application of autologous platelet-rich plasma. Dermatol Surg 2011; 37: 463–468.

28. Stenberg PE, Hill RJ. Platelets and megakaryocytes. In: Lee GR, Forester J, Lukens J, Paraskevas F, Greer JP, Rodgers GM, editors. Wintrobe’s clinical hematology. Tenth edition Egypt, 1999; 1:615-660.

29. Marx RE. Platelet rich plasma: evidence to support its use. J Oral Maxillofac Surg 2004; 62: 489-496.

30. Tamariz-Dominque E, Castro-Munozledo F, Kuri-Harcuch W. Growth factors and extracellular matrix proteins during wound healing promoted with frozen cultured sheets of human epidermal keratinocytes. Cell Tissue Res 2002; 307: 79-89.