Trombositten zengin plazma uygulamasının yara iyileşmesi üzerine etkisinin araştırılması

(1)

T.C.

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ

PLASTİK, REKONSTRÜKTİF ve ESTETİK CERRAHİ ANABİLİM DALI BAŞKANLIĞI

TROMBOSİTTEN ZENGİN PLAZMA UYGULAMASININ YARA İYİLEŞMESİ ÜZERİNE ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI

Dr. Niyazi GÜLSÜN TIPTA UZMANLIK TEZİ

DİYARBAKIR-2014

(2)

T.C.

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ

PLASTİK, REKONSTRÜKTİF ve ESTETİK CERRAHİ ANABİLİM DALI BAŞKANLIĞI

TROMBOSİTTEN ZENGİN PLAZMA UYGULAMASININ YARA İYİLEŞMESİ ÜZERİNE ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI

Dr. Niyazi GÜLSÜN TIPTA UZMANLIK TEZİ

Yrd. Doç. Dr. Caferi Tayyar SELÇUK (TEZ DANIŞMANI)

Diyarbakır – 2014

(3)

i

İÇİNDEKİLER

ÖNSÖZ ………..………..

ÖZET ………..……….

ABSTRACT ………..………..

KISALTMA LİSTESİ ………..………..

ŞEKİL LİSTESİ ………..………

TABLO LİSTESİ ………..………..

1.GİRİŞ VE AMAÇ ………..………..

2.GENEL BİLGİLER ………..………

2.1.Yara İyileşmesi ………..………

2.1.1.Yara İyileşmesinin Safhaları ………..………

2.1.2.Skar Dokusu ………..……….

2.2.Deri Grefti ………..………...

2.2.1.Tam Kalınlıkta Deri Grefti (Full thickness skin graft; FTSG) ………...

2.2.2.Kısmi Kalınlıkta Deri Grefti (Splitthickness skin graft; STSG) ………

2.2.3.Epidermis ………...………...………...

2.2.4.Dermis ………...………...………...

2.2.5.Deri Greftinin Tutması ……...………...………...

2.2.6.Cilt Grefti Donör Sahaları..………...………...

2.2.7.Deri Grefti Reddi ……...………...………...

2.3.Trombosit ……...………...………...

2.3.1.Trombosit Granül Yapısı ………...………...

2.3.2.Trombositlerden Salınan Büyüme Faktörleri ………...

2.3.3.Trombositten Zengin Plazma (platelet rich plasma; PRP)...

2.3.4.Trombositten Zengin Plazma Preparasyonu ……...

2.4.Mikrodiyaliz ……...……...……...

2.4.1.Mikrodiyaliz Tekniği ...……...……...

2.4.2.Mikrodiyaliz Problarının Kalibrasyonu ……...……...

2.4.3.Doku Hasarı ……...……...……...

3.GEREÇ VE YÖNTEM ...……...……...

3.1.Deney Grupları ...……...……...

3.2. Cerrahi Yöntem ...……...……...

iii iv vi viii ix x

1 2 2 2 7 7 8 8 9 10 10 11 12 12 14 14 15 16 17 18 19 20 21 21 21

(4)

3.3.Defekt Modeli ...……...……...

3.4.Trombositten Zengin Plazma Preparasyonu ...……...

3.5.Mikrodiyaliz Uygulaması ...……...……...

4. BULGULAR ...……...……...

4.1.Patolojik Parametrelerin İstatistiksel Bulguları ...……...

4.1.1. İnflamasyon ...……...……...

4.1.2.Fibrozis ...……...……...

4.1.3.Granulasyon ...……...……...

4.2.Mikrodiyaliz Verilerinin İstatistiksel Bulguları ...……...

4.2.1.Glikoz ...……...……...

4.2.2.Laktat ...……...……...

4.2.3.Gliserol ...……...……...

4.2.4.Pirüvat ...……...……...

5. TARTIŞMA ...……...……...

6. SONUÇ ...……...……...

7. KAYNAKLAR ...……...……...

22 23 25 27 28 29 29 30 32 32 34 35 37 40 45 46

(5)

iii ÖNSÖZ

“Deneysel Sıçan Tam Kat Doku Defekti Modelinde Trombositten Zengin Plazma Uygulamasının Yara İyileşmesi Üzerine Etkilerinin Araştırılması” adlı uzmanlık tezi Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Plastik Rekonstruktif ve Estetik Cerrahi Anabilim Dalı Başkanlığı tarafından verilmiş, 07 Haziran 2013 tarih ve 2013-37 sayı ile etik kurul onayı alınıp çalışmaya başlanmıştır.

Bu çalışmada deneysel olarak sıçanlarda sırt bölgesinde 3*2cm ebatlı tam kat doku defekti oluşturulmuştur. Oluşturulan tam kalınlıkta deri grefti ile birlikte trombositten zengin plazma kullanılmıştır. Aynı bölgede mikrodiyaliz uygulaması yapılarak doku hasarında değişiklik gösteren laktat, piruvat, glikoz ve gliserol değerleri postoperatif 1. gün, 7. gün ve 14. günlerde ölçülmüştür. Trombositten zengin plazmanın mikrodiyaliz veri istatistikleri ve histopatolojik olarak yara iyileşmesi üzerine etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır.

Uzmanlık eğitimim boyunca ve bu çalışmanın gerçekleştirilmesinde destek ve yardımlarını gördüğüm ve tez danışmanım Anabilim Dalı başkanımız Yrd. Doç. Dr. Caferi Tayyar Selçuk hocama, Doç. Dr. Mehmet Bozkurt hocama, Yrd. Doç. Dr. Mustafa Durğun hocama, Yrd. Doç. Dr. Burhan Özalp hocama, Yrd. Doç. Dr. Serkan Erbatur hocama, mikrodiyaliz uygulaması boyunca emeklerini esirgemeyen Prof. Dr. Salih Çelik’e ve Doç.

Dr. Veysi Akpolat’a, çalışmamın histopatolojik değerlendirilmesinde büyük katkısı olan Yrd. Doç. Dr. Ulaş Alabalık’a, istatistik değerlendirmelerde desteğini esirgemeyen Yrd.

Doç. Dr. İsmail Yıldız’a, klinikte birlikte çalıştığım araştırma görevlisi arkadaşlarıma saygı ve sevgilerimi sunarım.

(6)

ÖZET

Giriş ve amaç: Yara iyileşmesi bir organizmanın bir dokusunun fiziksel bütünlüğünün bozulması sonrası verdiği lokal ve sistemik yanıtı ifade eder. İnsan hayatında en karmaşık fizyolojik süreçlerden biri olan yara iyileşmesi bilim adamları ve klinisyenler tarafından çokaz anlaşılabilmiş olmakla birlikte bu alanda hızlı ilerleyiş ile yeni bilgilere ulaşılmaktadır. Yara iyileşmesi sırasında ortaya çıkan sitokinler, büyüme faktörleri, kemokinler ve benzerlerinin oluşturduğu liste oldukça kabarıktır.

Bu çalışmada oluşturulan doku defekti alanında greft uygulamasını takiben trombositten salınan büyüme faktörünün yara iyileşmesi sürecine etkisinin histopatolojik olarak değerlendirilmesi ve hücrelerarası sıvıda metabolitlerin mikrodiyaliz ile ölçülerek araştırılması amaçlanmıştır.

Materyal ve metod: Çalışma doku hasarı oluştrulmuş sıçanlarda trombositten zengin plazmanın protektif etkisinin değerlendirilmesinin planlandığı randomize olarak seçilecek 30 adet inbret Spraque-Dawley sıçan üzerinde planlanmıştır. Sıçanlar bilgisayar aracılığı ile randomizasyon litesine göre 8’ er adet sıçandan oluşan 3 gruba ayrıldı. Kalan sıçanlar trombositten zengin plazma hazırlanması amacı ile kan donörü olarak kullanıldı. Sıçanların ketalar anestezi sonrası sırt bölgesi traşlanarak ve 3×2 cm tam kat cilt defekti oluşturuldu.

Defekt amaçlı alınan doku örnekleri inceltilerek tam kalınlıkta deri grefti olarak tekrar insert edildi. 1. gruba intraoperatif trombositten zengin plazma (TZP; PRP; platelet rich plasma) enjeksiyonları yapıldı. 3. grup mikrodiyaliz öreneklemesi için kontrol grup olarak tutuldu ve herhangi cerrahi işlem yapılmadı. Her 3 gruptan operasyon sonrası 1. gün,7. gün ve 14. günlerde mikrodiyaliz yöntemi ile interstisyel örneklemeler alındı. Yara yeri bakımı günlük olarak ve klorhegzidinli tül gras sargılar ile yapıldı. Sonrasında postoperatif 21. gün histopatolojik incelemeler için doku örnekleri alındı.

Bulgular: Histopatolojik değerlendirmede cerrahi yapılan gruplar arasında özellikle inflamasyonda PRP uygulanmış grupta belirgin azalma olduğu görüldü. Yine cerrahi yapılan gruplar arasında mikrodiyaliz verileri karşılaştırıldığında glikoz, pirüvat ve laktat değerlerinde anlamlı farklar bulundu.

(7)

v

Sonuç: Deneysel sıçan tam kat doku defekti modelinde tam kat deri grefti ile birlikte trombositten zengin plazma kullanılarak histopatolojik ve mikrodiyaliz verilerinin istatistiksel değerlendirilmesi yapıldı. Trombositten zengin plazma uygulanan grupta hem histopatolojik hemde mikrodiyaliz sonuçlarında anlamlı farklar olduğu görüldü. Bu çalışma verilerine dayanarak trombositten zengin plazma uygulamasının klinik kullanımda defektif yaralarda öncelikli tedavi seçeneklerinden biri olabileceğine inanmaktayız.

(8)

ABSTRACT

Introduction and objective: Wound healing refers to the systemic and local response of an organism to the break down of the physical integrity of its tissue. Though wound healing is one of the most complicated physiologic processes and has been poorly understood by clinicians and scientists, fast advancements in this field reveals new information. Cytokines, growth factors, chemocines, and their similar which appear during healing process make up a long list.

In this study we aim to investigate the histopathologic evaluation of growth factors released from thrombocytes on wound healing after graft application to the tissue defect site and measuring metabolite concentrations in interstitial fluid by microdialysis technique.

Materials and Methods: Study was designed to evaluate protective effects of platelet rich plasma (PRP), on 30 randomly selected Spraque-Dawley rats with experimental tissue defects. Rats were separated into three groups, each with eight rats based on computerized randomization list. Remaining rats are used as blood donors for platelet rich plasma preparation. Following ketalar anesthesia, back of the rats is shaved and full thickness tissue defect of 3x2 cm was made. Tissue samples obtained for tissue defects, reinserted after thinning as skin grafts. Intraoperative platelet rich plasma injections were done to 1^st group. Third group was determined to be the control group for microdialysis and no surgical procedure was done. Interstitial samples were taken from all three groups on postoperative 1^st, 7^th, and 14^th days by microdialysis technique. Wound care was done daily by chlorhexidine tulle grass dressing. At postoperative 21^st day tissue samples were taken for histopathologic examination.

Results: Histopathoogic examination showed a particular decrease in inflammation, especially in platelet rich plasma applied group among the groups which are operated.

Additionally, microdialysis data showed significant differences in glucose, pyruvate, and lactate values in operated groups.

Conclusion: Statistical evaluation of microdialysis and histopathologic data of PRP application with full thickness skin graft used for reconstruction of experimental rat tissue

(9)

vii

defect were done. There were significant differences in histopathologic and microdialysis data of PRP applied group. Based on the results of this study we believe that PRP application can become one of the primary treatment options.

(10)

KISALTMA LİSTESİ

ADP: Adenozin diphosphates (adenozin difosfat) ATP: Adenozin triphosphates (adenozin trifosfat)

CTGF: Connective tissue growth factor (bağ doku büyüme faktörü)

DÜSAM: Dicle Üniversitesi Selahattin Payzın Deneysel Araştırma Merkezi EGF: Epidermal growth factor (epidermal büyüme faktörü)

FTSG: Full thickness skin graft (tam kalınlıkta deri grefti) HGH: Human growth hormon (insan büyüme hormonu) IFN: Interferon

IGF: Insulin like growth factor (insulin benzeri büyüme faktörü) IL: Interlökin

KGF: Keratinocyte growth factor (keratinosit büyüme faktörü)

LDGF: Leucocyte derived growth factor (lökosit kaynaklı büyüme faktörü) PDGF: Platelet derived growth factor (trombosit kaynaklı büyüme faktörü) PRP: Platelet rich plasma (trombositten zengin plazma)

PPP: Platelet poor plasma (trombositten fakir plazma)

TGF: Tranforming growth factor (dönüştürücü büyüme faktörü) TNF: Tumor necrosis factor (tümör nekrozis faktör)

VEGF: Vascular endothelial growt factor (damar endoteli büyüme faktörü)

(11)

ix

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil 2.1. Pıhtılaşma kaskadı ………..

Şekil 2.2. Kısmi kalınlıkta deri grefti kalınlıkları ………...

Şekil 2.3. Dermis ve epidermis yapısal elemanları ……….

Şekil 2.4. Aktive trombosittefilapod yapısı ……….

Şekil 2.5. Trombosit hücre elemanları ………

Şekil 2.6. Santrifüj sonrası kanın elemanlarına ayrılmış görünümü ………...

Şekil 3.1. Sıçan sırt bölgesi doku defekti modeli çizimi ……….

Şekil 3.2. Sıçan sırt bölgesi tam kat doku hasarı ………

Şekil 3.3. Tam kalınlıkta deri grefti uygulaması ………

Şekil 3.4. Tie-over dressing pansumanı ………..

Şekil 3.5. PRP enjeksiyonu ……….

Şekil 3.6. Anestezi altında ratta mikrodiyaliz uygulaması ……….

Şekil 3.7. Çelik şırınga ve soğutuculu fraksiyon toplayıcı görünümü (CMA 470) …………

Şekil 4.1. Kontrol grubundaki bir ratta normal epidermis ve dermis görünümü

(H&E,100x) ……….

Şekil 4.2. Kontrol grubundaki bir ratta normal epidermis ve dermis görünümü

(Masson Trikrom, 100x) ………...

Şekil 4.3. Grup 2’deki bir ratta yeni oluşan epitel altında yoğun inflamasyon

(H&E,200x) ……….…………..

Şekil 4.4. Grup 1’deki bir ratta epitel altında hafif inflamasyon (H&E,100x).……….

3 8 9 13 13 17 22 22 23 23 24 25 26

30

31

31 32

(12)

TABLO LİSTESİ

Tablo 2.1. Yara iyileşmesinde rol oynayan büyüme faktörleri ……….

Tablo 4.1. Donör sıçanlardan elde edilen PRP değerleri. (K/µL) ….………….….………...

Tablo 4.2. Grup 1, 2 ve 3’ teki deneklerde patolojik parametrelerin değerleri .….………...

Tablo 4.3. Grup 1 ve 2’ninKruskal-Wallis ile karşılaştırılması .….………….….………...

Tablo 4.4. Grup 1 ve 2’ ninKruskal-Wallis ile karşılaştırılması ….………….….………...

Tablo 4.5. Grup 1 ve 2’nin Kruskal-Wallis ile karşılaştırılması ….………….….………...

Tablo 4.6. 1. gün grupların mikrodiyaliz ile glikoz için tanımlayıcı bulgular .….………...

Tablo 4.7. 7. gün grupların mikrodiyaliz ile glikoz için tanımlayıcı bulgular .….………....

Tablo 4.8. 14. gün grupların mikrodiyaliz ile glikoz için tanımlayıcı bulgular .….………...

Tablo 4.9. Bonferoni Düzeltmeli Mann Whitney U testi ile Grup 2 ve Grup 3

Mikrodiyaliz Sonuçlarının Karşılaştırılması (P<0,05 alınmıştır) .….………...

Tablo 4.12. 1. gün grupların mikrodiyaliz ile laktat için tanımlayıcı bulgular .….………...

Tablo 4.13. 7. gün grupların mikrodiyaliz ile laktat için tanımlayıcı bulgular .….………...

Tablo 4.14. 14. gün grupların mikrodiyaliz ile laktatiçin tanımlayıcı bulgular .….………....

Tablo 4.18. 1. gün grupların mikrodiyaliz ile gliserol için tanımlayıcı bulgular .….………..

Tablo 4.19. 7. gün grupların mikrodiyaliz ile gliserol için tanımlayıcı bulgular .….………..

Tablo 4.20. 14. gün grupların mikrodiyaliz ile gliserol için tanımlayıcı bulgular …………..

4 27 28 29 29 30 32 32 33

33

34 34 34 34

35

35 36 36 36

36

37

(13)

xi

Tablo 4.24. 1. gün grupların mikrodiyaliz ile pirüvat için tanımlayıcı bulgular .………...

Tablo 4.25. 7. gün grupların mikrodiyaliz ile pirüvat için tanımlayıcı bulgular ………...

Tablo 4.26. 14. gün grupların mikrodiyaliz ile pirüvat için tanımlayıcı bulgular .………...

Mikrodiyaliz Sonuçlarının Karşılaştırılması (P<0,05 alınmıştır) .………...

37 37 38 38

38

39

(14)

1.GİRİŞ VE AMAÇ

Yara iyileşmesi bir çok hücre içi ve dışı uyaranlarla ayarlanan ve günümüzde tam öğrenilememiş bir süreçtir. Genel anlamda yara iyileşmesi hemostaz, yangı, fibroplazi, kollajen sentezi, epitelizasyon ve nedbe olgunlaşması olaylarından oluşur. İyileşme sürecinde hücre etkileşiminin moleküler kontrolü başlıca büyüme faktörleri ve sitokinler ile yapılır.

Deride meydana gelen yaralanma sistemik ve lokal olaylar zincirinin başlamasına neden olur. Yara iyileşme sürecini hızlandıran ajanların kullanımı ile tedavide olumlu etkiler sağlamak mümkündür. Trombositten zengin plazma (plateletreachplasma; PRP) yara iyileşmesini hızlandırdığı düşünülen etkilere sahiptir. Büyüme faktörleri polipeptid yapıya sahip hücre migrasyonu, proliferasyonu ve diğer fonksiyonları uyaran maddelerdir. Bu maddeler çoğu zaman ilk bulunduğu hücrelere göre isimlendirilmiştir (örn: trombositlerden salınan büyüme faktörü; PDGF- platelet derived growth factor). Büyüme faktörleri nmol miktarlarda bile önemli etkilere sahiptirler.

Biz çalışmamızda doku defekti oluşturulan cilt bölgesinde yara iyileşmesini hızlandırdığı düşünülen PRP’nin etkilerini araştırmayı amaçladık. Yara iyileşmesi tedavisinde kullanılan çok sayıda farklı ajan bulunmaktadır. PRP deneklerin dokularına uyumlu biyolojik bir ürün olduğu için yara üzerine alternatif sentetik maddelerden daha doğal etkiyecektir.

Mikrodiyaliz ölçüm metodu ile dokuların içeriğindeki vasküler kan akımı, iskemik değişiklikler, hücre kompartmanlarındaki sıvı dağılımı ve yoğunluğu değerlendirilebilmektedir. Bu bulgular tedavi sürecinde yaranın yanıtını takip etmede yararlı veriler elde edilmesini sağlayacaktır. Bu çalışma sonunda yara iyileşmesi üzerine etkili olduğu düşünülen bu maddenin etkinliği değerlendirilecek ve öncelikli tedavi seçeneği olarak sunulacağına inanmaktayız.

(15)

2 2.GENEL BİLGİLER

2.1.Yara İyileşmesi

Patolojik bir olay sonucu doku yada organın anatomik bütünlüğünün ve fonksiyonunun bozulması yarayı tanımlar. Yara iyileşmesi ise yaralanmadan sonra doku yada organın bütünlüğünün restorasyonu anlamına gelmektedir (1).

Epidermis rejenere olma kabiliyetinde iken dermiste oluşan yaralanmalar skar dokusu ile iyileşmektedir.

Yunanlı doktor Galen (MÖ 129-199) yara iyileşmesini primer ve sekonder yara iyileşmesi olarak 2 gruba ayırmıştır (2).Primer iyileşme yara dudaklarının düzgün ve temiz bu nedenlede 24 saat içinde epidermis rejenerasyonun olduğu dermisin ise minimal skar ile iyileşmesini tarifler. Geniş, kenarları düzensiz yaralardaki iyileşme sekonder iyileşmedir.

Bu tip yaralarda yara yüzeyinde epitelizasyon tamamlanamaz, yaranın ortasında derinliği doldurmak amacı ile granulasyon dokusu gelişmiştir. Oluşacak skar oldukça büyük ve fonksiyon kaybına yol açacak türdendir.

2.1.1.Yara İyileşmesinin Safhaları

Yara iyileşmesi birbirinden ayrılması güç, içiçe geçmiş devamlılık gösteren 3 safhadan oluşmaktadır.

İnflamatuarAşama: Yara iyileşmesinin inflamatuar fazı yaralanmayı takiben başlar. Bu aşamanın fonksiyonel özellikleri hemostazın sağlanması, ölü dokuların uzaklaştırılması ve invazivenfeksiyonların önlenmesidir. Bu faz hemostaz ve nötrofillerinin filtrasyonunun olduğu erken dönem ve makrofajlarınin filtrasyonu ile karakterize geç dönem olmak üzere ikiye ayrılır (3).Başlangıçta fibrilerkollajen ve doku faktörü de dahil yaralanmış dokunun komponentleri ekstrensek pıhtılaşma aşamalarını aktive etmek ve sürmekte olan kanamayı durdurmak için etki gösterirler. Trombosit kümeleri yırtılmış damarları tıkayan bir pıhtı oluşturur. Bu süreç sırasında trombositlerdegranüle olarak platelet kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) ve transforming büyüme faktörü-beta (TGF-beta) gibi büyüme faktörlerini ortama salar.

(16)

Şekil 2.1. Pıhtılaşma kaskadı

Başlangıçta fibriler kollajen ve doku faktörü de dahil yaralanmış dokunun komponentleri ekstrensek pıhtılaşma aşamalarını aktive etmek ve sürmekte olan kanamayı durdurmak için etki gösterirler. Trombosit kümeleri yırtılmış damarları tıkayan bir pıhtı oluşturur. Bu süreç sırasında trombositlerdegranüle olarak platelet kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) ve transforming büyüme faktörü-beta (TGF-beta) gibi büyüme faktörlerini ortama salar.

Yara bölgesinde inflamatuar hücreler ortaya çıkar. Bu inflamatuar hücreler kompleman sisteminin aktivasyonu (C5a), degranule olan trombositlerden salınan TGF-beta ve lipopolisakkaritler gibi bakteriyel degredasyon ürünleri tarafından bölgeye çekilirler.

Yaralanmayı takiben ilk 2 gün yara kavitesini dolduran fibrin matriksinin içine nötrofilik infiltrasyon olur. Bu hücrelerin primer görevi fagositoz yaparak ölü dokuları bölgeden uzaklaştırmak ve enfeksiyonu önlemektir. Nötrofillerinenfeksiyonu azaltma etkilerine karşılık yokluklarında yara iyileşmesi sürecinin duraksamayacağını bilmek önemlidir (4).

Nötrofiller ile birlikte masthücreleride yara yerine aynı zamanda ulaşırlar ancak kanda nötrofil sayısı daha fazla olduğu için inflamasyonun erken fazında yara yerinde nötrofiller daha fazla bulunurlar (5,6).

(17)

4

Tablo 2.1. Yara iyileşmesinde rol oynayan büyüme faktörleri

Büyüme Faktörü Kaynağı Görevleri Trombositkaynaklı büyüme faktörü

(Platalet-derivedgrowthfactor, PDGF)

Trombositler, makrofajlar endotel hücreleri, düz kas hücreleri

Fibroblastproliferasyonunu, nötrofil ve makrofajkemotaksisini ve proliferasyonunu, anjiogenezi arttırır Transforme edici büyüme faktörü

beta (Transforminggrowthfactor, TGF-)

Trombosit, nötrofil, lenfosit, makrofaj

Fibroblastproliferasyonunu,

kemotaksisinidirekt etkiler, anjiogenezde diğer büyüme faktörlerinin etkilerine yardımcı olur Epidermal büyüme faktörü

(Epidermalgrowthfactor, EGF)

Trombositler, anne sütü, plazma Epitel hücre ve fibroblastproliferasyonunuve

granülasyon dokusu oluşumunuuyarır Transforme edici büyüme faktörü

alfa (Transforminggrowthfactor ,TGF- )

Aktive makrofajlar, trombosit, keratinosit, bazı dokular

EGF'ye benzer

Interlökin- 1 ve interlökin- 2 (IL- 1,2)

Makrofaj, lenfosit, birçok doku ve hücre

Fibroblastproliferasyonuna, kollajenaz aktivitesine, nötrofilkemotaksisine etkir Tümör nekroz faktörü (Tümör

necrosisfactor, TNF)

Makrofaj, mast hücresi, T lenfositler

Fibroblastproliferasyonunu uyarır

Lökosit kaynaklı büyüme faktörü (Leucocytederivedgrowthfactor, LDGF)

Makrofaj, mast hücresi, T lenfositleri

Bağ dokusu hücreleri için kemoatraktanve mitojen etkilidir Bağ dokusu büyüme faktörü

(Connectivetissuegrowthfactor,

Endotel hücreler, fibroblastlar Bağ dokusu hücreleri için kemoatraktan

Fibroblast büyüme faktörleri (Fibroblastgrowthfactors, FGF)

Beyin, pitüiter bez, makrofajdiğer doku ve hücreler

Epitel hücre ve

fibroblastproliferasyonunu, matriks depolanmasını uyarır, anjiogenez, yara Keratinosit büyüme faktörleri

(Keratinocytegrowthfactors, KGF)

Fibroblastlar Epitel hücre proliferasyonunu arttırır

İnsülin benzeri büyüme faktörü 1 (İnsülin-likegrowthfactor-1, IGF-1)

Fibroblastlar Proteoglikanlar ve kollajen sentezini, fibroblastproliferasyonunu uyarır İnsan büyüme hormonu (Human

growthhormone, HGH)

Pitüiter bez, plazma Anabolizma, IGF-1 'i uyarır

İnterferonlar(IFN) Lenfositler, fibroblastlar Fibroblastproliferasyonunun ve kollajensentezinin inhibisyonunu sağlar

(18)

Yara yerine nötrofillerin ardından 48-72 saat sonra monositler/makrofajlar gelir.

Yaralanmayı izleyen üçüncü gün ortama hakim olan hücrelerdir. Makrofajlardebris ve bakterileri fagosite ederler. Ancak fibroblastların ekstrasellüler matriksin yapımı için ihtiyaç duydukları büyüme faktörlerinin üretilmesinde ve anjiogeneziste kritik rolleri vardır. Monosit/makrofajların yokluğunun iyileşmekte olan yaralar için çok kötü sonuçları vardır (7).

Lenfositler yaralanma bölgesine enson gelen hücrelerdir. Yaralanmadan 5 ile 7 gün sonra girerler. Yara iyileşmesindeki rolleri iyi tanımlanmamış olmakla birlikte CD4 ve CD8 hücre popülasyonlarının yara iyileşmesinin proliferatif aşamasını kolaylaştırdıkları ileri sürülmektedir (8).

Proliferatif Aşama: Genellikle yaralanmayı izleyen 4 ile 21. günlerde ortaya çıktığı kabul edilir. Yara bölgesine komşu olan keratinositler yaralanmayı takip eden saatlerde fenotiplerini değiştirirler. Kısmi yaralanmalarda saç folikülleri ve ter bezlerinin boşaltım kanallarıda keratinosit kaynağı olabilmektedir. Keratinositler ve arasındaki (desmozom) ve bunların altta yatan bazal membranlaolan bağlantılarındaki (hemidesmozom) regresyon hücreleri serbestleştirir ve laterale hareket etmelerini sağlayacak psödopodlar oluşur. Oluş mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte kalsiyumun rolü olduğu düşünülmektedir (9,10). Epidermal mitoz yaralanmadan 48 saat sonra zirve yapar ve bu aktivite 17 kat artabilir (11, 12, 13).Yara kenarlarından epitel oluşum hızı 1mm/gün’dür.

Yara kenarlarında göç eden epitel hücreleri birbirlerine değdiklerinde yeni epitel oluşumu sonlanır. Keratinositler orijinal formlarına dönerek desmozomal ve hemidesmozomal bağlantılar tamamlanır (14,15).

Yeni epitel oluşumu için 2 mekanizma tartışılmaktadır.

1. Leap-frogging Teorisi: Yara kenarındaki epitel bazal tabakasındaki hücrelerin 4-5 hücre çapı kadar yara bölgesine ilerledikten sonra durmaları ve bu hücrelerin üzerindeki hücrelerin onların üstüne göçü ile tariflenir.

(19)

6

2. Tractor-tread Teorisi: Yara bölgesindeki fibronektine epitel hücrelerinin bağlanmasını sağlayan ve epitel hücre hareketini açıklayan yine epitel hücreleri üzerindeki integrin reseptör varlığına dayanan teoridir.

Geçici fibrin matriksigranulasyon dokusu ile yer değiştirmeye başlar. Granulasyon dokusu fibroblast, makrofaj ve endotelyal hücrelerden oluşur. Granulasyon dokusu; kollajen tip 1 ve tip 3, fibrin, fibronektin, proteoglikanlardan oluşmuş matriks yapıdadır. Yaklaşık yaralanmayı takip eden 4. günde ortaya çıkar. Makrofajlar salgıladıkları PDGF ve TGF- beta ile fibroblastları ekstrasellüler matriks içine prolifere ve migre ederken aynı zamanda endoteliyal hücreleri anjiogenez için aktive ederler. Endotel hücreleride yeni damar yapımı ile makrofaj ve fibroblastların metabolik ihtiyaçlarını karşılarlar (16). Proliferasyon fazında oluşan granulasyon dokusundaki makrofaj ve fibroblastların yara iyileşmesinin diğer safhasına geçişi sağlamak için yoğun bir aktivite göstermeleri gerekir. Bu aktivite içinde bol oksijen ve ek besin gerekir. Bu nedenle anjiogenez proliferasyon fazının kilit fonksiyonlarındandır (17,18).

Fibroblastlar ise yara bölgesini doldurarak hem kollajenhemdekollajen dışı ekstrasellülermatriks sentezi yaparlar. Ayrıca fibroblast göçünü uyaran bazı büyüme faktörlerinin ve kemotaktik faktörlerin etkisi ile miyofibroblastlar oluşur (19,20). Her 2 hücrede aynı zamanda yara kontraksiyonunda rol oynarlar.

Yara kontraksiyonu yaranın büyüklüğünü sınırlamak amacı ile yaralanmadan sonra 7. Gün başlayan yara etrafındaki sağlam dokunun yara ortasına hareketidir. Kontraksiyon miktarı yara derinliği ile ilişkilidir. Deriyi tam kat tutan yaralanmalarda yara kontraksiyonuda fazla olmaktadır.

Myofibroblastların düz kas hücresi gibi davranarak kasılması sonucu etraflarındaki hücreleri ve ekstrasellüler matriks komponentlerini etkileyerek çalıştıkları düşünülmektedir. Ayrıca fibroblastlarında ekstrasellüler matriks elemanlarına özel bir çekim uygularak yara kontraksiyonuna etkidikleri savunulmaktadır.

Yeniden şekillenme evresi: Bu dönem doku hasarından yaklaşık 3 hafta sonra başlar aylar hatta yıllarca devam eden ve yara iyileşmesinin en uzun fazını oluşturan dönemdir.

Epidermis ve yeni oluşan ekstrasellülermatrikste bazı değişiklikler meydana gelir. Bu

(20)

dönemde bazal membran ve matriks üzerinde dizilmiş olan bazal hücreler normal tabakalanmayı oluşturmak üzere farklılaşır. Yeni oluşan kollajen liflerin çatısını oluşturan hyaluronik asit kondroitin sülfatla yer değiştirir. Kollajen liflerin çapraz bağları artar;

kollajenaz ile fazla miktarda sentezlenmiş olan kollajen yıkılarak tip 3 kollajen tip 1 ile yer değiştirir. Ayrıca devaskularizasyon olur (21).

2.1.2.Skar Dokusu

Fizyolojik Skar: Normal iyileşen yarada oluşan skardır.

Patolojik Skar: Hipertrofik skar ve keloid olmak üzere 2 çeşittir.

Hipertrofik skar: Çok fazla miktarda deri kollajeni içerir. Keloid gibi yara kenarındaki normal dokuya taşmaz. Genetik geçiş az görülür. Yaralanmadan sonraki ilk ayda görülür ve yavaş büyür. Eksizyon ile sonuç alınabilmektedir.

Keloid: Sık görülmez. Zencilerde otozomal dominant geçişli genetik yatkınlık vardır.

Tipik olarak yaralanmadan birkaç ay sonra meydana gelir. Hipertrofikskardan en önemli farkı yaranın etrafına uzanım gösterir ve oluşan skarorjinal yaradan daha büyüktür. Keloid dokularından alınan fibroblastların sağlıklı dokulardaki fibroblastlardan 2 ile 3 kat daha fazla kollajen ürettiği saptanmıştır (22). Spesifik tedavisi yoktur.

2.2.Deri Grefti

Deri greftleri primer olarak kapatılamayan ve hatta flep ile örtülemeyen defektlerin onarımında tek seçenek olarak karşımıza çıkmaktadır.

Herhangi bir travma sonucu zarar görmüş epidermis ve dermisin tam kat kaybını içeren defektif yaralar greft için adaydır. Küçük boyutlu tam kat kayıplar kıl foliküllerinin köklerinde bulunan epidermis hücreleri sayesinde yeniden rejenere olma şansına sahiptirler. Ancak geniş ve tam kat kayıplarda greft ihtiyacı muhakkaktır.

Terminoloji;

Otogreft: Greft aynı kişiden alınıp yine aynı kişideki defekt onarımında kullanılmıştır.

Allogreft (homogreft): Aynı tür ama farklı bireyler arasında yapılan transferdir.

(21)

8

Heterogreft (xenogreft): Farklı türler arasında yapılan greftlemeyi tarifler.

İzogreft: Genetik yapısı aynı canlılar arasında yapılan grefttir(Tek yumurta ikizleri arasında yapılan greft) (41).

2.2.1.Tam Kalınlıkta Deri Grefti (Full thickness skin graft; FTSG): Epidermisin ve dermişin tamamını içeren greftlerdir. Ter ve yağ bezleri, nöral uç organları ve kıl foliküllerini içermektedir.Tam kalınlıkta deri greftleri travmalara daha dirençlidirler.

Kozmetik açıdan daha iyi bir görünüme sahiptirler ve sekonder kontraksiyonları daha azdır (42).

2.2.2.Kısmi Kalınlıkta Deri Grefti (Splitthickness skin graft; STSG): Epidermisin tamamını dermisin ise bir kısmını içeren deri greftleridir. İnce, orta ve kalın kısmi kalınlıkta olmak üzere üçe ayrılır. Donör alan morbiditesinin daha az olması ve mesh greft ile daha geniş alanların kapatılabilmesi avantajlarıdır.

Şekil 2.2. Kısmi kalınlıkta deri grefti kalınlıkları

(22)

Primer kontraksiyon; Verici sahadan henüz ayrılan dokuda gelişen kontraksiyondur.

Dermisteki elastine bağlı olarak gelişir ve greft ne kadar dermis içeriyorsa primerkontraksiyonda okadar fazla olacaktır. FTSG lerde %40; orta kalınlıkta STSG lerde

%20, ince STSG lerde ise %10 primerkontraksiyon görülür.

Sekonder kontraksiyon; Miyofibroblast aktivitesine bağlı olarak gelişen iyileşmiş greftte görülen kontraksiyondur. Normalde FTSG’ lerde sekonder kontraksiyon daha az olmak birlikte rijid bir yüzeye uygulanmamış ise STSG lerde sekonder kontraksiyon görülür.

Uygulanan greftteki dermis yüzdesi sekonder kontraksiyon önlenmesinde önemlidir. İntakt dermal kollajen miktarı önemli iken greftin oryantasyonunun, epidermis miktarının, non- kollajen protein miktarının etkisi yoktur.

2.2.3.Epidermis: Oldukça ince ve avaskülerbir yapıdır. 5 tabakadan oluşur. İçeriden dışarıya doğru stratum bazale, stratum spinozum, stratum granulozum, stratum lusidum ve stratum korneumdur. Epidermis enaz 4 hücreden oluşur. Bunlar keratinositler, melanositler, Langerhans hücreleri ve Merkel hücreleridir (43).

Greftlemeden sonraki ilk 4 gün STSG‘ lerdegreftepitelinde bir aktivite artışı söz konusudur. Bu artış FTSG’ lerde ya azdır yada hiç yoktur. Bunun sonucu greft kalınlığı 2 kat artar. Olası nedenleri; epitel hücre nukleus ve stoplazmasının şişmesi, greft yüzeyine doğru olan hücre göçü ve foliküler ve glanduler hücrelerdeki mitoz artışıdır. 4. haftanın sonunda epidermis normal kalınlığa ulaşmış olur.

Şekil 2.3. Dermis ve epidermis yapısal elemanları

(23)

10

2.2.4.Dermis: Yüzeydeki papiller tabaka ile derindeki retiküler tabakadan oluşur (41). Çok katlı skuamöz bir epitelden oluşur ve temel hücre grupları fibroblast, makrofaj ve mast hücreleridir.

Büyük kısmını tip 3 kollajen oluşturur. Kollajeni fibroblastlar üretirken mast hücreleri tip1 immun yanıttan sorumludur. Makrofajlar ise genel temizleyici görevi görürler (43,44,45).

Deri greftlerindeki fibroblastların orijinleri hala bilinmemekle birlikte perivasküler mezenşimal hücrelerden geldikleri düşünülmektedir. İyileşen greftlerdeki fibroblastların önceden mevcut fibrositlerden gelmediği konusunda ortak bir fikir vardır.

Deri greftlerinde terleme kapasitesi transfer edilmiş ter bezi miktarına ve greftin sempatik reinnervasyonuna bağlı olarak değişiklik gösterir. Alıcı bölgenin özelliklerini kazanırlar.

Hem STSG’lerdehemde FTSG’lerdesebasegland aktivitesi mevcuttur.

FTSG’lerde kıl büyümesi olurken STSG’lerde ya çokaz bir kıl büyümesi olur yada hiç olmaz.

Granulasyonla sekonder iyileşmeye bırakılan yaralar en fazla kontrakte olurlar ve hipertofikskar gelişimine eğilimlidirler. İnce olursa sekonderkontraksiyonda okadar fazla olur.

2.2.5.Deri Greftinin Tutması: Greftin uygulandığı bölgenin kanlanması ve uygulama sırasında greftinmetabolik aktivitesi greftin tutmasını etkileyen faktörlerdir.3 aşamada gerçekleşmektedir.

Serum imbibisyon: İlk aşama olup 24-48 saat sürmektedir. Uygulanan deri greftleri belirli bir süre iskemik kalırlar. Bu süre taze oluşturulmuş yaralarda 48 saat granulasyon gelişmiş yaralarda ise 24 saattir. Serum imbibisyon bu dönemde greftin yaşamını sürdürmesini sağlar. Greft alttaki dokuya fibrin ile yapışır. Fibrinojen, trombin ve diğer enzimler ortama salınır. Greft canlılığı diffüzyon ile sağlanır. Allttaki doku ile teması olmayan deri greftleri vücut ısısında saklansalar dahi ömürleri 4 günü geçmez. Kanlanması zayıf bir alana konan deri grefti için serum imbibisyon dönemide daha uzun olacaktır (46).

(24)

Revaskularizasyon: Greft konulduktan 48 saat sonra başlar. Kabul görmüş 3 teori vardır;

1. Teori; İnoskulasyon: Donör ve alıcı saha arasındaki anostomozları tarifler.

2. Teori; Sekonder revaskularizasyon:’ agöre ise alıcı yataktan yeni bir damarlanmanın grefte doğru ilerlemesidir ve 4.-7. Günler arasında gerçekleşir (47).

3. Teori ise her ikisinide kapsar Smahel ve Zoltan (48) tarafından tanımlanmış olup öncelikle inoskulasyon ardından sekonder revaskularizasyonun gerçekleştiğini iddia eder.

En az kabul gören teoride budur.

Maturasyon: Revaskularizasyondan sonra mitoz başlar ve greft 7 kat daha ince bir hale gelir (48). 10 gün sonra deskuamasyon olmakta ve normal kalınlığa dönmektedir.

FTSG daha kalın olduğu için yaşaması daha güvenilmezdir ve kanlanması iyi bir yatağa ihtiyaç duyar.

Periost, perikondrium veya paratenonu olmayan kemik kıkırdak veya tendonda greft tutması nadirdir.

Otojen deri greftlerindeki en önemli başarısızlık nedeni hematomdur. 2. en sık neden enfeksiyondur. Greft üzerine uygulanmış aşırı basıda nekroza neden olabilir. Bu yüzden greft üzerine 30mmHg dan fazla basınç uygulanmamalıdır.

Lenfatik staz, yetersiz immobilizasyon, venözkonjesyon, arteriyel yetmezlikte greft kaybına neden olabilecek diğer sebeplerdir. Ayrıca kirli yaralardaki yüksek bakteri sayısı ve plazmin aktivitesi greftin altında yapışmasına neden olan fibrini parçalayarak greftin tutunmasına engel olmaktadır.

2.2.6.Cilt Grefti Donör Sahaları

Epidermis kıl folikülü gövdesindeki epidermal hücrelerin ve dermisteki eklerin göç etmesi sonucu rejenere olur ancak dermis asla rejenere olmaz. Bu nedenle kısmi kalınlıkta alınan deri greftleri dermisin bir kısmını içerdiğinden donör saha rejenere olup tekrar verici olarak kullanılabilir. Buna karşı tam kalınlıkta alınan deri greftleri donör sahaları primer

(25)

12

kapatılmalıdır ki bu nedenlede küçük olmak zorundadırlar. STSG için skalp, kalça, abdomen ve uyluk donör olarak kullanılabilir.

2.2.7.Deri Grefti Reddi

Deri grefti reddi immünolojik bir hadise olupgreft tutmamasından farklıdır. Endotel hücresine karşı geliştirilen antikor cevap sorumlu tutulmaktadır. Greft reddinden sorumlu temel uyaran donör tipi interstisiyel dentritik hücreler yada donörün antijenlerini karşılayan alıcı dentritik hücrelerdir. Donördentritik hücreleri allogreft reddinden en çok sorumlu uyarandır (49).

O bölgeyi drene eden lenf noduna doğru ilerler (50). Epidermisteki langerhans hücreleri makrofaj benzeri hücrelerdir ve deride antijen sunan temel hücrelerdir (51).

2.3.Trombosit

Trombositler kemik iliğindeki megakaryositlerin parçalanmasından oluşan, çekirdeksiz, hacmi 10 fentolitre ve çapı 1-5 mikrometre olan ovoid veya küresel yapılardır. En küçük kan hücreleridir. Fosfolipid yapıda 2 tabaka arası glikoprotein, kolesterol ve glikolipitten oluşan trilaminar bir yapıya sahiptirler. Periferik kanda ömürleri ortalama 7-10 gündür.

Hücre zarının en dış tabakasını oluşturan glikokaliks adezyon ve agregasyondan sorumludur. Plazma membranının sitoplazmaya doğru yaptığı uzantılar sayesinde sitoplazmada bulunan aktif moleküllerin dışarıya atılmasını sağlayan kanal sistemine açık kanaliküler sistem denir. İkinci bir kanal sistemi olan yoğun tübüler sistem ise trombosit aktivasyonunda gerekli kalsiyumu depolar. Kandaki ortalama değeri 140000-400000mm3 arasındadır. Ömrünü tamamlayan trombositler retiküloendoteliyal sistem makrofajlarınca ortamdan uzaklaştırılır (23,24).

Trombosit hücre iskeletinin %20-30 unu aktin mikroflamanları oluşturur.Aktive olan trombositlerde aktin mikroflamanları hücre hareket ve agragasyonunu sağlayan filapod adı verilen yüzey çıkıntılarını oluştururlar.

(26)

Şekil 2.4. Aktive trombositte filapod yapısı

Aktivasyon sırasında oluşan şekil değişikliklerinden mikrotubul denen protein yapılar sorumludurlar. Trombosit adezyonundan dış yüzeyinde bulunan glikozaminoglikan ve glikoproteinden zengin tabaka sorumludur (25).

Şekil 2.5. Trombosit hücre elemanları

yapısı

(27)

14 2.3.1.Trombosit Granül Yapısı

Trombositin içinde mitokondri ve mikrotübüller ile birlikte çeşitli (alfa, delta, lambda) granüller bulunur.

Alfa (α) granüller: Her trombositin içinde 30’a yakın biyoaktif madde bulunduran 50-60 alfa granül vardır.300-500 nm çapında hemostaz, yara iyileşmesi ve inflasmasyonda önemli olan protein molekülleri içerirler. Trombositlerin majör granülleridir. Heterojen içeriğe sahiptirler. Alfa granülleri; trombosit kaynaklı büyüme faktörü (platelet-derived growth factor: PDGF), dönüştürücü büyüme faktörü α ve β (transforming growth factor:

TGF- α ve TGF- β), epidermal büyüme faktör (epidermal growth factor: EGF) ve damarsal endotelyal büyüme faktörü (vascular endothelial growth factor: VEGF) gibi çeşitli büyüme faktörleri ayrıca sitokinler ve kemokinler içermektedir(26,27).

Delta (δ) granüller:250-300nm çapında olup elektron mikroskobu altında ışığı yoğun absorbe etmelerinden ötürü dens görünüme sahiptirler. Bu nedenle de yoğun cisimler olarakta adlandırılırlar. Pirofosfat, ADP, ATP, kalsiyum iyonları gibi protein olmayan molekülleri içermekle birlikte plazma düzeyinin 100 katı kadar konsantrasyonda serotonin depolarlar.

Lambda (λ) granüller: 175-250nm çapında lizozomal enzimleri içeren veziküllerdir.

Bakterisidal etki ile birlikte fazla pıhtıyı eritici özellikleri mevcuttur (28).

Trombositlerin en önemli fonksiyonları hemostaz ve yara iyileşmesi üzerine olan etkileridir. Doku hasarı sırasında aktive olan trombositler subendoteliyal ve kapiller bazal membranındaki kollajene bağlanırlar. ADP ve trombin ile agregasyon artar ve sonuçta fibrin tıkaç meydana gelir.

Yara iyileşmesinde ise trombositlerden salınan büyüme faktörleri inflamasyon, proliferasyon, remodelling ve skar oluşumu gibi her 3 aşamadada görev alırlar (23, 24,29).

2.3.2.Trombositlerden Salınan Büyüme Faktörleri

İnsülin benzeri büyüme faktörü (İnsulin like growth factor; IGF): IGF-1 ve IGF-2 dahil, vasküler endotel hücreleri için kemotaktik role sahiptir. Böylece vaskülerendotel

(28)

hücrelerinin hasarlı alana migrasyonunu uyarır, anjiogenezi destekler ve PDGF ile birlikte endotel ve epidermis yenilenme oranını arttırır(30,31).

TGF-β (Transforming growth factor-β): Kollajen, fibronektin, glikozaminoglikan gibi birçok matriks proteini sentezinde rol oynarken yara yerinde kemotaktik ve anjio genetik etkiside vardır. Bu özellikleri ile birlikte derinin yeniden yapılandırılmasında hayati bir rol oynamaktadır.

PDGF (Platelet derived growth factor): Doku yaralanması sonrası ilk tespit edilen faktörlerdendir. Trombositlerden adezyon sırasında salgılanır. Adezyon ADF, trombin, kollajen, adrenalin, serotonin, kaolin, ristosetin vb. maddelerle uyarılabilir.

Fibroblastaktivasyonu, kollajen birikimi ve anjiogenez üzerine etkileri vardır. Endotel hücrelerinin büyümesini uyararak hasarlı bölgedeki fibroblastların sayısını arttırır, nötrofil ve monositlerin farklılaşmasını sağlar. Böylece kapiller damar oluşumu, kolajen üretiminin arttırılması ve granülasyon oluşumu desteklenir.

VEGF (Vasculer endothelial growth factor): ‘in iskemik yaralarda topikal kullanımının yara iyileşmesini hızlandırdığı ve kan akımını arttırdığı tespit edilmiştir (32). VEGF endotel hücrelerinin çoğalmasını uyarır, böylece yeni damar oluşumunu arttırır, mevcut kapiller damar geçirgenliğini arttırır ve hücre büyümesi ve anjiogenez için gerekli mikro çevreye katkıda bulunur.

2.3.3.Trombositten Zengin Plazma (platelet rich plasma; PRP)

PRP bazal plazma değerinin 3 ile 5 kat fazla yoğunlukta trombosit içeren otolog plazma kısmıdır. Normal kan trombosit sayısı 150000-400000mm3 seviyelerinde olmakla birlikte standart bir PRP için istenen değer en az 1000000mm3 tür (33). Küçük miktarda plazma içerisinde konsantre trombosit süspansiyonu içerir (34, 35, 36).

Trombositlerin hemostazdaki rolünün geçmişi uzun zaman öncelere dayanmasına rağmen yara iyileşmesi üzerine olan etkilerinin tespiti yakın zamanlara dayanmaktadır.

PRP; özellikle ortopedik, periodontik, maksillofasiyal, plastik, torakal, damar cerrahisive oftalmolojide kullanılmaktadır.

(29)

16

PRP ve ürünleri; yara iyileşmesini, hücresel mitogenezi, osteogenezi ve anjiogenezi arttırıcı özelliği nedeni ile klinik uygulamalarda yeri bulunan güncel bileşimlerdir (36, 37, 38).

PRP derideki ülserlerde kullanılmış, dokuda granülasyon dokusu oluşumu ve epitelizasyonun hızlanmasında etkili olduğu gösterilmiştir(30).

Eppley ve ark.(39) tarafından yapılan bir araştırmada kronik ülserlerin tedavisinde granülasyon dokusunun epitelizasyonunu hızlandırmak için PRP faktörlerinin kullanılabileceği ileri sürülmüştür.

PRP’nin kemik ve yumuşak doku iyileşmesinde olumlu etkilerinin bulunduğuna dair bazı çalışmalar mevcuttur (34).

PRP kontrendikasyonları

Trombositopenik, hipofibrinojenemisi, karaciğer hastalığı, malignitesi olan hastalar; akut ve kronik enfeksiyonlarda, hamile ve emzirenlerde, otoimmün hastalığı olanlarda, kan ve kan ürünlerine karşı hassasiyeti olduğu bilinen kişilerde PRP kullanımından kaçınılmalıdır.

2.3.4.Trombositten Zengin Plazma Preparasyonu

Yüksek doz intraperitonealpentobarbital 1 gr flakon (PentothalSodium®, Abbott İlaç Sanayii, İstanbul, Türkiye) uygulanarak sakrifiye edilen donörizogeneikinbret sıçanlardan intrakardiyak yolla 5-8 cc kan alındı. 25°C’lik oda ısısında alınan kan örneği 1.26 ml %10 sodyum sitratantikoagulanı içeren Eppendorf tüpüne alındı. Ardından 2400 rpm hızında 10dk santrifüj edildi. Santrifüj sonunda tüpün kısmında trombositten fakir plazma (PPP;

plateletpoorplasma), ortada gri renkli PRP tabakası ve en alt kısımda da eritrosit ve lökosit süpernatantı ayrıştırıldı. PPP kısmı pipet yardımı ile ayrıldı. PRP kısmı aspire edilerek tekrar 15dk 3600 rpm de santrifüj edildi. Trombositlerin çökmesi sağlanmış oldu. Sonuçta yaklaşık 0.8-1.2 ml PRP elde edilmiş oldu. Elde edilen PRP cerrahi uygulama öncesinde 0.25cc %10 kalsiyum klorid solüsyonu ve 0.125cc 300 IU domuz trombin solüsyonu (Fibriquick® Thrombin, BioMerieuxInc, Durham, NC, USA) ile karıştırıldı ve PRP’nin aktive olması sağlandı (40). Preparasyon sonrasında elde edilen süpernatanttan0.3 cc örnek alınarak trombosit düzeyi ölçüldü.

(30)

Şekil 2.6. Santrifüj sonrası kanın elemanlarına ayrılmış görünümü

2.4.Mikrodiyaliz

Mikrodiyaliz canlı dokulardaki ekstrasellüler kimyanın ölçülmesine imkan veren bir monitörizasyon yöntemidir. Mikrodiyaliz ölçüme dayalı bir örnekleme yöntemi olup analitik cihazlara bağlandığında seçilmiş dokularda madde konsantrasyonu ölçümüne yardımcı olmaktadır. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında mikrodiyalizin avantajı hücrelerarası sıvıda sürekli olarak bağlı olmayan yani serbest madde fraksiyonunu sürekli olarak örnekleyebilmesidir.

1970’lerde bulunmasından sonra ağırlıklı olarak laboratuar araştırmalarında kullanılmıştır.1990’lardan itibaren mikrodiyaliz klinik sahaya uygulanmaya başlanmış ve günümüzde birçok uzmanlık alanı tarafından kullanılmaktadır. İnsanlarda mikrodiyaliz kullanılarak yapılan ilk çalışma 1987 yılında yapılmıştır (84).

Bu metod diyaliz membranın canlı doku içerisine yerleştirilmesi ve ekstraselüler alanda serbest olarak bulunan partiküllerden oluşan numunenin toplanması esasına dayanır. Buna göre elde ettiğimiz sonuçlar medikal tedavinin etkilerini ve ilaç konsantrasyonlarını monitörize etmek ayrıca cerrahi komplikasyonların erken belirteçlerini tespit etmek için

(31)

18

kullanılır. Temel araştırma dahilinde, mikrodiyaliz kemirgenler ya da büyük hayvanlarda neredeyse çoğu dokuda ya da organda moleküllerden numune almak için kullanılır. İskemi, glükoz değerini düsürerek ve laktat seviyesini arttırarak ve ayrıca laktat/pirüvat oranını arttırarak, glikoz metabolizmasında bazı bilinen değişikliklere sebep olur. Hücre hasarı, gliserol ve glutamat seviyesinin artmasına sebep olur. Reaktifler;

glikoz, laktat, pirüvat, gliserol, glutamat ve ürenin analizi için kullanılabilir.

Birçok tıbbi sağlık hizmeti uzmanı yeterli ilaç doku dağılımının öneminin farkında olup, farmasötik ajanlar için genel olarak doku-plazma ilaç konsantrasyonu dengesinin sağlandığını düşünür. Bu yüzden plazma konsantrasyonu ilaç uygulamalarında sıkça ölçülür. Bu yaklaşım etkilerini kan akımında gösteren ilaçlar için geçerli olmasına rağmen, periferikkompartmanlarda etki gösteren ilaçların plazma ölçümleri özellikle plazma ve doku farmakokinetikleri bireysel farklılıklar gösterebildiğinden sağlıklı değildir(85, 86).

Hedef bölgesindekim dokularda ilaç konsantrasyonunun ölçmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Bunların arasında cilt bülleri, doku biyopsisi, fibrin pıhtıları, cilt ve doku bölgeleri, yara eksudalarındaki ilaç konsantrasyonları ve lenf sıvısı ölçümü vardır. Tüm bu geleneksel yöntemler çoğunlukla pato-fizyolojik kısımlar açısından eksiktir ve insanlarda hedef dokulardaki ilaç konsantrasyonları hakkında kısıtlı bilgi vermektedir (87). İlacın etki bölgesinde ilaç konsantrasyonunu belirlemede alternatif ve umut verici bir yöntem mikrodiyaliz tekniğidir. Klinik farmakokinetik çalışmalara 1991 yılında sunulmuştur (88, 89).

Geleneksel yöntemlerden farklı olarak mikrodiyaliz çeşitli dokulardaki hücrelerarası sıvıda serbest ilaç konsantrasyonu ölçümlerinin direk ve sürekli olarak yapılmasına olanak tanır.

İyi tanımlanmış bir bölge olan interstisyum birçok antimikrobiyal ve kemoterapötik (52) ajan ve etkilerini hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanarak gösteren bir çok ilaçla ilişkili bir bölgedir. Mikrodiyaliz başta subkutan tabakayla sınırlıyken bu teknik günümüzde yumuşak doku (53,54), tendinöz doku (55,56), kalp kası (57,58), beyin (59) ,kemik (60), akciğer (61), ve tümöral dokularda (62,63) ilaç konsantrasyonu ölçmek için kullanılmaktadır.

2.4.1.Mikrodiyaliz Tekniği

Mikrodiyaliz kullanan ilk klinik çalışmalar bu yöntemin hedef doku interstisyumunda ilaç konsantrasyonu ölçümünde yöntemin uygun olduğunu ve çözünmüş maddelerin

(32)

konsantrasyon-zaman çizgilerinin baz çizgisine göre göreceli değişimlerinin açıklama olanak tanıdığını göstermiştir. Sinirbilim ve metabolik çalışmalarda metabolik bozuklukların uygun şekilde tespiti ve tedavinin buna göre düzenlenmesi göreceli değişimlerin tanımlanmasında çoğunlukla yeterliyken klinik farmakokinetik çalışmalar hücrelerarası sıvıdaki çözünen maddelerin kesin konsantrasyon-zaman profilleri hakkında bilgi sağlamayı hedefler. Bu yüzden bu ilk klinik deneyler mikrodiyalizprobları için uygun kalibrasyon gerektiğini vurgulamıştır.

Mikrodiyaliz probları hücre zarına zarar vermemek için dokulara rehber kanüllerle yerleştirilmelidir. Klinik farmakokinetik çalışmalardaki mikrodiyalizprobukonsantrik şekildedir (63,64,65). Bu tip mikrodiyalizprobları ya çelik gövdeye sahiptir yada tamamen plastik olup yumuşak dokularda hareket edebilmek için maksimum esneklik sağlar. Bu yüzden esnek problar ayaktan hastalar ve sağlıklı bireylerde adipoz doku ve iskelet kası gibi yumuşak dokuları ilgilendiren farmakokinetik çalışmalar için uygundur.

Konsantrikproblar ince iç kanülün dış kanülden dışarı çıktığı iki kanülden oluşur. Diyaliz zarı olarak görev gören silindir şeklindeki diyaliz tüpü bir tarafı kapatırken diğer taraf ise dış gövdenin kenarına bağlıdır. İç kanül neredeyse probun kapalı ucuna kadar uzanmaktadır.

Mikrodiyaliz probunun iç boru sistemi hassas bir pompayla bağlıdır. Mikrodiyalizprobu sabit şekilde genelde fizyolojik RingerLaktat olan perfüzyon sıvısıyla ~1.5 µL/dk akış hızında perfüze edilir. Perfüzyon sıvısının akış hızı büyük oranda deneyde gereken çözünmenin süresine ve analitik deneyin hassasiyetine göre değişir. Perfüzyon sıvısı iç kanülün proksimal ucundan girer. Daha sonra akım ters yöne devam edip sıvı dış kanülün proksimal ucuna doğru hareket eder. Probun ucunda perfüzyon sıvısı ve interstisyum arasında diyaliz gerçekleşir. İki kompartman arasında net sıvı değişimi olmaz.ancak moleküller her 2 yönde geçiş yapar. Membranın iki tarafındaki konsantrasyon farkı değişimin hangi yönde olacağını belirler. Perfüzyon sıvısı (perfüzat) hücrelerarası sıvıdan gelen çözünmüş maddelerle kısmi olarak dengeye gelir ve mikrodiyalizprobunu dış tüp yoluyla terk edip diyalizat adını alır. Diyalizatta kimyasal analize gönderilir.

2.4.2.Mikrodiyaliz Problarının Kalibrasyonu

Denge yöntemi geleneksel olarak mikrodiyalizproblarının in vivokalibrasyonunda kullanılmaktadır (84). Ancak bu yöntem zaman alıcı olmakla birlikte deneysel koşullarda

(33)

20

halihazırda olmayan kararlı hal durumu olmasını gerektirmektedir. Bu yüzden Stahle ve ark. tarafından (88) 1991’ de daha az zaman gerektiren ve yüksek oranda çoğaltılabilen

‘’ters diyaliz’’ probkalibrasyon yöntemi öne sürülmüştür. Günümüzde bu kalibrasyon yöntemi çeşitli analitlerinabsolütintersitisyel konsantrasyonunu ölçmede sıkça kullanılmaktadır. Mikrodiyaliz deneylerinde bireyler arası varyasyon katsayısının %10- 20 arasında oldukça düşük olduğu gösterilmiştir (88, 90).

2.4.3.Doku Hasarı

Mikrodiyaliz probu sokulduktan sonra dokuda meydana gelen dolaşım değişiklikleri laser Doppler kullanılarak gösterilmiş ve tüm değişikliklerin 40 dakika sonra baz seviyeye geri döndüğü tespit edilmiştir (91). Küçük çaplı dializ tüplerinin yerleştirilmesinin hayvanlarda majör ödeme, yabancı cisim reaksiyonuna ya da kanamaya yol açmadığı gösterilmiştir (92).

(34)

3.GEREÇ VE YÖNTEM

Deneysel çalışmaya başlanmadan önce Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Yerel Etik Kurul Başkanlığı’ndan yerel etik kurul onayı alındı (07 Haziran 2013 tarih ve 2013-37 protokol no ile). Denekler Dicle Üniversitesi Prof. Dr. Selahattin Payzın Deneysel Araştırma Merkezi’ nden (DÜSAM) temin edildi. Çalışmaya 30 adet erkek 250-300 gr. ağırlığında, 9 aylık, izogeneik (inbret) Spraque-Dawley albino sıçan dahil edildi. Sıçanlar standart toplu kafeslerde barındırıldı. Yemler standart pellet şeklinde verildi. (TAVAS Inc, Adana, Türkiye) ve su ihtiyaçları standart yöntemlerle karşılandı. Oda ısısı yaklaşık 21°C’de sabit tutuldu. Laboratuar ışıklandırması 12 saat gündüz ve 12 saat gece olacak şekilde ayarlandı.

Odanın nem derecesi %45±10 düzeyinde kalacak biçimde ayarlandı. Tüm prosedürler tek cerrah tarafından uygulandı.

3.1.Deney Grupları

Sıçanlar randomizasyon listesine göre (computer generated randomization list) seçilerek, her bir grup 8 sıçandan oluşacak şekilde 3 grup oluşturuldu. Tüm denekler kodlama sistemine göre işaretlenerek numaralandırıldı. Grup 1 tam kalınlıkta doku defekti oluşturularak deri grefti yapılarak PRP uygulanan grup, Grup 2 tam kalınlıkta doku defekti oluşturularak sadece deri greft yapılan grup ve Grup 3 te cerrahi yada medikal hiçbir işlem yapılmadan referans kafes kontrol grubu şeklinde takip edilen ve mikrodiyaliz ölçümleri yapılıp normal değerler elde edilen ve kayıt altına alınan grup şeklinde ayrıldı.

3.2. Cerrahi Yöntem

Deney gruplarına Ketamin sodyum (Ketalar® flakon; Pfizer Ltd Şti, İstanbul, Türkiye) 90mg/kg ve xylazine hidroklorid (Rompun® flakon, Bayer Inc, Almanya) 10mg/kg karışımı intraperitoneal olarak uygulanıp genel anestezi sağlandı. Sıçanların sırt bölgesi traşlanıp %10’luk povidon iyodin solüsyonu (Batticon®, Adeka İlaç Ltd Şti, Samsun, Türkiye) ile dezenfekte edildi. Operasyondan 1 saat önce sefazolin sodyum 0.25gr/kg (Sefazol® flakon, Mustafa Nevzat İlaç Sanayii, İstanbul, Türkiye) intramüsküler yolla uygulandı. Yine oprasyondan 1 saat önce cerrahiye bağlı sıvı açığını yerine koymak amacıyla 1.5cc serum fizyolojik enjekte edildi.

(35)

22 3.3.Defekt Modeli

Öncelikle sıçan yüzüstü pozisyonda deney masasına sabitlendi. Daha sonra cerrahi saha yeşil örtü ile çevrelendi. Sıçanın sırt bölgesine 3×2cm boyutlu çizim yapıldı.

Şekil 3.1. Sıçan sırt bölgesi doku defekti modeli çizimi

Çizime uygun insizyon ile cilt ve ciltaltı doku geçildi. Fasyaya kadar disseksiyon uygulandı. Fasya korunarak doku tam kat ve bütün olarak eksize edildi. Kanama odakları bipolar koter ile koagule edildi.

Şekil 3.2. Sıçan sırt bölgesi tam kat doku hasarı

Eksize edilen doku diseksiyon makası yardımı ile inceltildi. Dermis ve epidermis korunarak FTSG haline getirildi. Subdermal doku eksizyonu sonrası FTSG olarak hazırlanan doku uygun pozisyonda eski yerine insert edildi.

(36)

Şekil 3.3. Tam kalınlıkta deri grefti uygulaması

Suturasyon işlemi 4/0 poliglekapron (Monocryl®, Ethicon®, Norderstedt, Germany) ile yapıldı. Klorhegzidinli tül grass sargı ile tie over dressing pansuman yapılarak greft sahası kapatıldı.

Şekil 3.4. Tie-over dressing pansumanı

3.4.Trombositten Zengin Plazma Preparasyonu

Yüksek doz intraperitoneal pentobarbital 1 gr flakon (Pentothal Sodium®, Abbott İlaç Sanayii, İstanbul, Türkiye) uygulanarak sakrifiye edilen donör izogeneik inbret sıçanlardan intrakardiyak yolla 5-8 cc kan alındı. 25°C’lik oda ısısında alınan kan örneği 1.26 ml %10 sodyum sitrat antikoagulanı içeren Eppendorf tüpüne alındı. Ardından 2400 rpm hızında 10dk santrifüj edildi. Santrifüj sonunda tüpün kısmında trombositten fakir plazma (PPP;

(37)

24

platelet poor plasma), ortada gri renkli PRP tabakası ve en alt kısımda da eritrosit ve lökosit süpernatantı ayrıştırıldı. PPP kısmı pipet yardımı ile ayrıldı. PRP kısmı aspire edilerek tekrar 15dk 3600 rpm de santrifüj edildi. Trombositlerin çökmesi sağlanmış oldu.

Sonuçta yaklaşık 0.8-1.2 ml PRP elde edilmiş oldu. Elde edilen PRP cerrahi uygulama öncesinde 0.25cc %10 kalsiyum klorid solüsyonu ve 0.125cc 300 IU domuz trombin solüsyonu (Fibriquick® Thrombin, BioMerieux Inc, Durham, NC, USA) ile karıştırıldı ve PRP’ nin aktive olması sağlandı (40). Preparasyon sonrasında elde edilen süpernatanttan 0.3 cc örnek alınarak trombosit düzeyi ölçüldü.

Grup 1 deneklerine greft onarımı sonrası her 4 kadranda yara kenarlarına subdermal enjeksiyon şeklinde PRP uygulandı. Her kadran için yaklaşık 2 dzm uygulama insülin enjektörü yardımı ile yapıldı.

Şekil 3.5. PRP enjeksiyonu

Cerrahi sonunda intraperitoneal salin solüsyonu( 10 ml/kg/cerrahi süre-saat) enjekte edildi.

Ardından intramüsküler yolla metamizol sodyum (Novalgin® 1gr/2ml ampül, Sanofi- Aventis Ltd Şti, İstanbul, Türkiye) 0.25 ml uygulanarak analjezi sağlandı. Analjezik dozu operasyon sonrası 12, 24, 48. Saatlerde tekrarlandı. Cerrahi sonrası 1. günde intraperitoneal serum fizyolojik enjeksiyonu tekrarlandı. Antibiyotik proflaksisine postoperatif 3. Güne kadar devam edildi.

(38)

3.5.Mikrodiyaliz Uygulaması

CMA/mikrodiyaliz (SN- T18258- 1) analizör kullanılan mikrodiyaliz uygulaması postoperatif 1. gün, 7. gün ve 14. gün her 3 gruptan deneklerde kullanıldı. Mikrodiyaliz 10 dk. süre ile 2.0 mmol/L hızında ve 1µL diyalizat örneği alınacak şekilde yapıldı.

Çalışmamızda kullanılan problar (CMA- 11 mikrodiyaliz probu) iç çapları 0.12 mm, iç hacimleri 1.2 µL, uzunlukları ise 100 mm ölçülere sahiptiler. Yapı malzemeleri polyethersulfano (PES) idi. Kullanılan şaft malzemesi çelik yapıda olup çapı 0.64 mm, uzunluğu 14 mm, membran çapı 0.5 mm ve ağız içi hacmi 3 µL idi. CMA 402 şırınga ve CMA 470 soğutuculu fraksiyon toplayıcı kullanıldı.

T1 mikrodiyaliz uygulamaları için izotonik, steril ve periferal dokulara uygun perfüzyon sıvılar kullanıldı.

İnterstisyel alandan alınan diyalizat örnekleri analiz edilebilmesi için kaset halinde ürün ve içeriğinde glikoz, laktat, pirüvat ve gliserol ölçümleri yapabilecek özellikte reagent kitler kullanıldı. Uygulama öncesi kit kapsamında kalibrasyon sıvısı ile kalibrasyon yapıldı.

Şekil 3.6. Anestezi altında ratta mikrodiyaliz uygulaması

(39)

26

Şekil 3.7. Çelik şırınga ve soğutuculu fraksiyon toplayıcı görünümü (CMA 470)

(40)

4. BULGULAR

Takip döneminde 2. Grupta sadece bir sıçanda greft sahasında kısmi nekroz izlendi.

Nekrotik saha debride edilerek postoperatif 12. günde sekonder iyileşme ile defekt kapandığı görüldü.

Araştırıcılar bulguları yorumlarken deney gruplarını bilmeksizin çift-kör olarak değerlendirdi.

Tablo 4.1. Donör sıçanlardan elde edilen PRP değerleri. (K/µL)

PRP hazırlandıktan sonra alınan örneklerden elde edilen trombosit düzeyleri Tablo 4.1’de gösterilmiştir.

Elde edilen trombosit düzeylerinin ortalama ve standart sapma değerleri 780,3 ± 34,53 olarak bulundu.

Denek No

1 2 3 4 5 6

PRP

DEĞERLERİ 726 794 827 786 805 744

(41)

28

4.1.Patolojik Parametrelerin İstatistiksel Bulguları

Tablo 4.2. Grup 1, 2 ve 3’ teki deneklerde patolojik parametrelerin değerleri

(Sıfır) 0: bulgu yok 1: hafif bulgu

2: orta derecede bulgu 3: belirgin bulgu

Değişkenlerin gruplar arası karşılaştırmalarında Kruskal-Wallis testi kullanıldı. Grup 3’ e herhangi bir cerrahi işlem uygulanmadığı için çalışmaya dahil edilmedi.

Grupla

r Denek No İnflamasyon Fibrozis Granulasyon

GRUP 1

1 1 1 1

2 2 1 1

3 1 1 1

4 1 1 1

5 2 1 1

6 1 1 2

7 1 1 1

8 1 1 1

GRUP 2

1 2 1 2

2 2 1 1

3 2 1 2

4 2 1 1

5 2 1 2

6 3 1 1

7 2 1 1

8 2 1 1

GRUP 3

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

(42)

4.1.1. İnflamasyon

Tablo 4.3. Grup 1 ve 2’nin Kruskal-Wallis ile karşılaştırılması

Kruskal Wallis (Ki-Kare) Grup

Toplam

P değeri

1.Grup 2.Grup

İnflamasyon 1 Pozitif Sayı 6 0 6

0,008

Yüzdesi 100,0% ,0% 100,0%

2 Pozitif Sayı 2 7 9

Yüzdesi 22,2% 77,8% 100,0%

Yüzdesi ,0% 100,0% 100,0%

Toplam Sayı 8 8 16

Yüzdesi 50,0% 50,0% 100,0%

Grup 1 ve 2 arasında P<0.05 anlamlı fark bulundu.

4.1.2.Fibrozis

Tablo 4.4. Grup 1 ve 2’ nin Kruskal-Wallis ile karşılaştırılması

Gruplar arası farklı pozitif olmadığından karşılaştırma yapılamamıştır.

Toplam

1.Grup 2.Grup

Fibrozis 1 Pozitif Sayı 8 8 16

Yüzdesi 50,0% 50,0% 100,0%

Toplam Sayı 8 8 16

Yüzdesi 50,0% 50,0% 100,0%

(43)

30 4.1.3.Granulasyon

Tablo 4.5. Grup 1 ve 2’nin Kruskal-Wallis ile karşılaştırılması.

P<0.05 hesaplandı ve Grup 1 ile 2 arasında granulasyon açısından anlamlı fark bulunamadı.

Şekil 4.1. Kontrol grubundaki bir ratta normal epidermis ve dermis görünümü (H&E,100x)

Toplam P değeri

1.Grup 2.Grup

Granulasyon 1 Pozitif Sayı 0,008 5 12

0,248

Yüzdesi 58,3% 41,7% 100,0%

Yüzdesi 25,0% 75,0% 100,0%

Toplam Sayı 8 8 16

Yüzdesi 50,0% 50,0% 100,0%

(44)

Şekil 4.2. Kontrol grubundaki bir ratta normal epidermis ve dermis görünümü (Masson Trikrom, 100x)

Şekil 4.3. Grup 2’deki bir ratta yeni oluşan epitel altında yoğun inflamasyon (H&E,200x)