Phrygia Bölgesi 1 Hierapolis

Todas as etapas da fase analítica devem ser realizadas de acordo com as normas internacionais de Boas Práticas de Laboratório (BPL) e

conforme o guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos – Resolução – RE 899/03 (BRASIL, 2002a, 2003l, 2004d).

Método analítico

O método analítico, empregado para determinação de um fármaco e/ou seus metabólitos em matrizes biológicas, é fator determinante para assegurar a exatidão, precisão e especificidade dos dados obtidos a serem utilizados para a interpretação da biodisponibilidade relativa/bioequivalência, bem como de outros estudos farmacocinéticos (EMEA, 2002; JACKSON, 1994).

A realização prévia das etapas necessárias ao desenvolvimento do método analítico para os estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência assegura ao centro analítico e ao patrocinador que o estudo será realizado no prazo previsto e com confiabilidade dos resultados. Evita-se, assim, a reprovação do estudo por problemas na condução da etapa analítica (BRASIL, 2002a).

Validação

O método bioanalítico, empregado para quantificação do fármaco em matriz biológica, deve sempre ser descrito detalhadamente na forma de protocolo ou procedimento operacional padrão (POP) e ser validado para sua aplicação. É recomendável o uso de métodos cromatográficos; no entanto, existem situações em que tais métodos não podem ser utilizados, sendo necessária a utilização de ensaios imunológicos ou microbiológicos. Esses métodos possuem características específicas que devem ser consideradas durante a validação (BRASIL, 2003l; FDA, 2001a; EMEA, 2002; JACKSON, 1994; SHAH et al., 2000).

A validação do método bioanalítico consiste em determinar parâmetros que garantam a aceitabilidade, performance e confiabilidade do método, a saber: (i) estabilidade da solução estoque do padrão do analito e do padrão interno; (ii) estabilidade do analito na matriz biológica; (iii) especificidade; (iv) exatidão; (v) precisão; (vi) linearidade; (vii) limite de

quantificação, (viii) recuperação e (ix) robustez. Para tanto, esses parâmetros devem ser validados na etapa de planejamento do estudo, uma vez que o limite de quantificação está diretamente relacionado com o cronograma de coleta, e este com as características do fármaco. Falhas na determinação desses parâmetros podem acarretar a reprovação do estudo, por exemplo, pela não-quantificação das três meias-vidas de eliminação, em função do limite de quantificação ser muito alto (BRASIL, 2003l; FDA, 2001a; EMEA, 2002; JACKSON, 1994; SHAH et al., 2000).

Curva de calibração

A curva de calibração representa a relação entre a resposta do detector e a concentração conhecida do analito, devendo ser construída uma curva para cada corrida analítica para cada analito, utilizando-se a mesma matriz biológica. Uma amostra branco (isenta de padrões) e uma amostra zero (apenas com o padrão interno) e no mínimo 6 concentrações diferentes do padrão (todas contendo padrão interno) devem ser incluídas. A correta preparação da curva é fundamental, pois a concentração do fármaco nas amostras serão calculadas a partir das curvas. A faixa de linearidade compreende o limite de quantificação até 120% da concentração mais alta que se pretende analisar (BRASIL, 2003l, FDA, 2001a).

Os critérios de aceitação da curva de calibração devem ser seguidos exatamente como preconiza o guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos, pois qualquer desvio desses critérios afetará a confiabilidade dos resultados, podendo ocasionar a rejeição do estudo. Destaca-se que o desvio deve ser sempre calculado em relação à concentração nominal e não deve ser superior a 20% para o limite de quantificação, nem superior a 15% para as demais concentrações. No mínimo, quatro das seis concentrações devem apresentar desvios inferiores ou iguais aos limites descritos, incluindo-se o limite de quantificação e a maior concentração da curva (BRASIL, 2003l; FDA, 2001a).

Estabilidade

A estabilidade de fármacos e/ou metabólitos em líquidos biológicos é uma função do tempo, da temperatura de armazenamento, da matriz biológica e do material de acondicionamento, não podendo ser extrapolada, portanto, para outros tipos de matrizes biológicas, materiais de acondicionamento ou temperatura (BRASIL, 2003l, 2004d; FDA, 2001a).

O estudo de estabilidade deve ser realizado impreterivelmente antes da realização do estudo de bioequivalência, pois, assim, assegurará a estabilidade do fármaco na matriz biológica, durante todas as fases do estudo, compreendidas em: (i) coleta e preparo da amostra (estabilidade à temperatura ambiente de curta duração, determinada após 4 e 24 horas), (ii) período de armazenamento que contemple a coleta da primeira amostra e a análise da última amostra (estabilidade de longa duração); (iii) após três ciclos de congelamento e descongelamento (prevendo a necessidade de descongelamento para re-análise); (iv) pós-processamento da amostra incluindo o padrão interno (período em que a amostra fica no auto-injetor). As soluções de padrão do fármaco e do padrão interno também devem ter seu período e condições de estabilidade determinadas (BRASIL, 2003l; FDA, 2001a).

O procedimento mais adequado para condução de um estudo de estabilidade consiste em: (i) preparação de um “pool” de matriz biológica + fármaco em diferentes concentrações, de acordo com a linearidade do método e com os controles de qualidade a serem utilizados na validação das corridas analíticas; (ii) determinação das concentrações das replicatas das diferentes amostras (normalmente três replicatas das concentrações baixa e alta) no tempo zero, utilizando-se curva de calibração e controles de qualidade (CQ) para validação da corrida analítica; (iii) cálculo da média, exatidão e precisão; (iv) distribuição do “pool” em número suficiente de alíquotas, de maneira a permitir a avaliação de todas as condições necessárias do estudo de estabilidade e em número suficiente de replicatas, de acordo com o guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos – Resolução – RE 899/03; (v) determinação de cada condição; (vi)

comparação das médias de cada condição com as médias das replicatas das análises no tempo zero. (BRASIL, 2003l, FDA, 2001a).

Os resultados obtidos são comparados com as concentrações médias das amostras no tempo zero ou frescas através da aplicação de regra de três, em que as concentrações iniciais são consideradas 100%. A porcentagem resultante indica a degradação do fármaco e não pode ultrapassar 15% para o fármaco ser considerado estável (BRASIL, 2003l).

Critérios para aceitação do método

Todos os parâmetros da validação do método devem ser realizados de forma a atender a legislação vigente. Preferencialmente, todas as amostras de um mesmo voluntário são analisadas na mesma corrida analítica, sendo que esta deve conter: padrões de calibração, amostras de controle de qualidade e amostras dos voluntários (BRASIL, 2003l; FDA, 2001a).

As amostras de controle de qualidade necessitam ser incorporadas em intervalos adequados, dependendo do número total de amostras da corrida, sempre em igual número de replicatas de cada concentração (baixa, média e alta), sendo o número de amostras sempre em múltiplos de três, e não devendo ser inferior a 5% do número total de amostras desconhecidas. Os resultados das amostras de CQ servirão de base para a aceitação ou rejeição da corrida analítica. No mínimo 67% (quatro de seis) das amostras de CQ devem estar dentro de mais ou menos 15% dos seus respectivos valores nominais, exceto para o limite de quantificação, para o qual se admitem desvios menores ou iguais a 20%. Ressalta-se que os 33% das amostras que podem estar fora desses limites (duas de seis) não poderão ser da mesma concentração. A determinação do intervalo de confiança para comparação da exatidão e precisão é uma alternativa adequada (BRASIL, 2003l; FDA, 2001a).

A análise das amostras poderá ser efetuada nas seguintes condições: sem réplica, em duplicata ou triplicata. Para análise de amostras em

duplicata ou triplicata, os critérios de aceitação dos resultados devem ser descritos no POP (BRASIL, 2004d; FDA, 2001a).

Todas as determinações com valores menores que o limite inferior de quantificação são consideradas iguais a zero para os cálculos estatísticos (BRASIL, 2004d; FDA, 2001a).

A rastreabilidade dos resultados é fundamental para a confiabilidade do estudo. Para tanto, os cromatogramas devem apresentar dados de identificação da corrida e da amostra, concentração calculada, parâmetros (analito e padrão interno), relação dos parâmetros analito (padrão/interno), tempos de retenção (analito e padrão interno), data e hora (BRASIL, 2003g).

Enantiômeros e racematos

A FDA recomenda a determinação de enantiômeros nos estudos de biodisponibilidade. Tratando-se de estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência recomenda a determinação do recemato utilizando um ensaio aquiral. A determinação de enantiômeros em estudos biodisponibilidade relativa/bioequivalência, somente será realizada quando as seguintes condições forem atendidas: (i) os enantiômeros exibem diferentes características farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas; (ii) a segurança e eficácia primária está relacionada ao enantiômero de menor concentração; (iii) a absorção é não-linear em pelo menos um dos enantiômeros. Nesses casos, devem ser determinadas, separadamente, biodisponibilidade relativa/bioequivalência para cada enantiômero (FDA, 2003).