Durante a análise dos níveis de expressão dos genes de degradação proteica no mutante skn-1 obtivemos resultados reprodutíveis para oito dos treze genes em questão, sendo eles vha-6, vha-8 e vha-12, que codificam para a subunidade H+-ATPase vacuolar e pbs-2, pbs-3, pas-4, pas-6 e rpt-5 que codificam para a subunidade catalítica/regulatória 20S do proteassoma (Figura 7). Não foi observada diferença significativa na expressão dos genes vha-6, vha-12, pbs-2, pbs-3, pas-6 e rpt-5 (Figura 7). Por outro lado, a expressão dos genes vha-8, envolvido em degradação proteica lisossomal, e pas-4, envolvido em degradação proteica proteassômica, foi consideravelmente reduzida (88% e 57% de redução, respectivamente) no mutante skn- 1(zu135) (Figura 7).
4.3 ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PROTEASSOMA
Outra estratégia usada para demonstrar o envolvimento do fator de transcrição SKN-1 na degradação proteica foi quantificar a atividade proteassômica no skn- 1(RNAi). Para confirmar a qualidade do extrato proteico bruto nós utilizamos o MG-132 como inibidor e ATP como ativador da atividade proteassômica. Como o esperado, entre os animais controle(RNAi), na presença do MG132, observamos uma redução na atividade proteolítica exógena de 45.7%, 46.4% e 21.3% nos experimentos 1, 2 e 3, respectivamente (Tabela 7). Valores semelhantes foram observados nos animais skn- 1(RNAi) (46.2%, 33.5% e 26.2%) (Tabela 7). Para nossa surpresa, também houve uma
48 diminuição na atividade proteolítica exógena na presença do ativador ATP, que resultou em redução da atividade proteolítica exógena de 73.1%, 69.5% e 39.8% entre os animais controle(RNAi), e 70.2%, 54.6% e 18.8% entre os animais skn-1(RNAi) nos experimentos 1, 2 e 3, respectivamente (Tabela 7). Embora a adição de ATP ao tenha resultado em aumento da atividade proteassômica, é importante ressaltar que em todos os experimentos realizados houve um aumento da atividade proteolítica exógena nos animais skn-1(RNAi) em relação aos animais controle(RNAi) (230%, 860% e 110% de aumento nos experimentos 1, 2 e 3 , respectivamente) (Tabela 7). A Figura 8 apresenta dados representativos de um dos experimentos da medida da atividade proteolítica.
49 Tabela 6: Valores de CT para os genes candidatos à referência endógena nas linhagens N2, skn-1(zu135) Gene CT N2 CTskn-1 act-1 18,39 ± 0,135 18,09 ± 0,009 ama-1 29,91 ± 0,007 26,94 ± 0,007 cdc-42 28,39 ± 0,168 26,94 ± 0,089 gpd-2 26,09 ± 0,029 24,37 ± 0,055 pmp-3 31,01 ± 0,237 28,43 ± 0,011 tba-1 24,29 ± 0,147 21,36 ± 0,055
50 Figura 7: Quantificação relativa (2-ΔΔCT) dos níveis de expressão de oito genes de degradação proteica regulados por SKN-1 nos animais tipo selvagem e mutante skn- 1(zu135). A normalização foi feita em relação à expressão de act-1(linha padronizada em 1,0). *p<0,05. Dados representativos de dois experimentos.
51 Figura 8: Efeito do RNAi para skn-1 na atividade proteolítica exógena. *p<0,05.
52 Tabela 7: Medida da atividade proteolítica exógena, expressa em unidades de fluorescência obtidas em um minuto por µg de proteína, dos animais skn-1(RNAi) em comparação aos animais controle(RNAi). Dados representativos de três experimentos.
Fluorescência/min/50ug proteína controle(RNAi) skn-1(RNAi) Experimento 1 Extrato 0,1869 ± 0,01 0,4412 ± 0,07 Extrato + ATP 0,0502 ± 0,00 0,1312 ± 0,00 Extrato + MG132 0,1014 ± 0,00 0,2372 ± 0,00 Experimento 2 Extrato 0,022 ± 0,00 0,1524 ± 0,01 Extrato + ATP 0,0067 ±0,00 0,0692 ± 0,00 Extrato + MG132 0,0118 ± 0,00 0,1013 ± 0,00 Experimento 3 Extrato 0,2722 ± 0,03 0,3123 ± 0,02 Extrato + ATP 0,1640 ± 0,00 0,2536 ± 0,03 Extrato + MG132 0,2142 ± 0,00 0,2306 ± 0,00
53 4.4 ANÁLISE DO PADRÃO DE AGREGADOS POLIGLUTAMÍNICOS
Treze dos genes ativados por SKN-1 foram previamente identificados como capazes de prevenir a formação de agregados proteicos na linhagem transgênica unc- 54p::Q35::YFP contendo 35 repetições poliglutamínicas (Q35) fundida à proteína amarelo fluorescente (YFP). (Nollen e cols., 2004; Oliveira e cols. 2009). Neste projeto, a agregação poliglutamínica foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência pela contagem individual dos agregados em animais submetidos à skn-1(RNAi), daf- 16(RNAi) e controle(RNAi).
Inicialmente, o efeito do skn-1(RNAi) foi avaliado nos transgênicos unc- 54p::Q35::YFP e unc-54p::Q40::YFP (Figura 9) que têm a expressão da proteína poliQ direcionada para as células musculares da parede do corpo do animal.
No transgênico unc-54p::Q35::YFP, nenhum agregado foi observado nos animais controle(RNAi) em nenhum dos estágios analisados (média de 0,06 agregados por indivíduo). Nos animais daf-16(RNAi), como o esperado, foi observado um aumento significativo no numero de agregados nas três fases analisadas, sendo uma média de três agregados nos animais em L4 e 0,8 agregados nos animais adultos de quatro e seis dias. Nós também pudemos observar um aumento significativo no número de agregados em 20 a 50% dos animas skn-1(RNAi) nas fases de L4 e adulto de seis dias, sendo a média de um agregado em L4, 0,025 agregados em adulto de quatro dias e 0,25 agregados em adultos de seis dias (Figura 10).
Não foram observadas alterações no número de agregados no transgênico expressando 40 glutaminas (unc-54p::Q40::YFP) entre os animais controle(RNAi), daf- 16(RNAi) e skn-1(RNAi) (Figura 11). Nestes, os animais controle(RNAi) apresentaram, em média, 10.4 agregados em L4, 92,1 agregados em adulto de quatro dias e 112,3 agregados em adulto de seis dias. Os animais daf-16(RNAi) apresentaram uma média de 10,45 agregados em L4, 88,8 agregados em adulto quatro dias e 101,4 agregados em adulto de 6 dias e os animais skn-1(RNAi) apresentaram em média 10,5 agregados em L4, 93,5 agregados em adulto quatro de dias e 97,5 agregados em adulto de seis dias.
Nós também analisamos o padrão de agregação poliglutamínica nas linhagens vha-6p::Q44::YFP, vha-6p::Q64::YFP e vha-6p::Q82::YFP (Figura 12) que têm a expressão da proteína poliQ direcionada para o intestino, justamente o órgão onde SKN-
54 1 é preferencialmente expresso. Nestes transgênicos nós observamos uma tendência na redução no número de agregados nos animais skn-1(RNAi) como pode ser observado nas figuras 13-15.
No transgênico vha-6p::Q44::YFP, os animais controle(RNAi) apresentaram, em média, 0,9, 17,3 e 22,2 agregados em L4, adulto de quatro dias e adulto de oito dias, respectivamente. Valores aproximados foram encontrados nos animais daf-16(RNAi) (0,4, 17,8 e 18,9 ) enquanto nos animais skn-1(RNAi) pudemos observar uma redução significativa no número de agregados nos adultos de oito dias em comparação com o controle(RNAi). Estes animais apresentaram, em média, 0,9, 12,0 e 9,9 agregados em L4 e adulto de quatro e seis dias, respectivamente (Figura 13).
No vha-6p::Q64::YFP, os animais controle(RNAi) apresentaram 16,3, 34,9 e 36,2 agregados em média em L4, adulto de quatro e oito dias, respectivamente. Os animais daf-16(RNAi), em fase de adulto de quatro dias, apresentaram um aumento significativo no número médio de agregados quando comparados com o controle(RNAi), sendo encontrados, em média, 18,8, 48,0 e 37,8 agregados nos animais em L4, adulto de quatro dias e adulto de oito dias, respectivamente. A média de agregados poliglutamínicos foi significativamente reduzida nos animais skn-1(RNAi) na fase de adulto de quatro e oito dias. Estes transgênicos apresentaram 14,2, 19,0 e 23,7 agregados em L4, adulto de quatro e oito dias, respectivamente (Figura 14).
Animais transgênicos vha-6p::Q82::YFP também apresentaram uma redução significativa no número médio de agregados nos animais skn-1(RNAi) na fase de adulto de quatro e oito dias. Para nossa surpresa, animais adultos de quatro dias submetidos à daf-16(RNAi) também apresentaram significativa redução no número de agregados. O número médio de agregados neste transgênico foi de 21,7, 24,9 e 16,8 no controle(RNAi) em L4, adulto de quatro e seis dias, respectivamente. Nos animais daf- 16(RNAi) a média de agregados foi de 21,2, 15,6 e 19,9 em L4, adulto de quatro e seis dias, respectivamente e nos animais skn-1(RNAi) foi de 22,0, 17,6 e 11,2 agregados em L4, adulto de quatro e seis dias, respectivamente.
55 Figura 9: Padrão de expressão poliQ::YFP dos transgênicos unc-54p::Q35::YFP e unc- 54p::Q40::YFP submetidos a RNAi para daf-16 e skn-1.
56 Figura 10: Efeito do RNAi para daf-16 e skn-1 no número médio de agregados proteicos nos animais unc-54p::Q35::YFP nas fases L4, adulto de quatro e seis dias.*p<0,05. Média de dois experimentos.
Figura 11: Efeito do RNAi para daf-16 e skn-1 no número médio de agregados proteicos nos animais unc-54p::Q40::YFP nas fases L4, adulto de quatro e seis dias. Dados representativos de um experimento.
57 Figura 12: Padrão de expressão poliQ::YFP dos transgênicos vha-6p::Q44::YFP, vha- 6p::Q64::YFP e vha-6p::Q82::YFP submetidos a RNAi para daf-16 e skn-1.
58 Figura 13: Efeito do RNAi para daf-16 e skn-1 no número médio de agregados proteicos nos animais vha-54p::Q44::YFP nas fases L4, adulto de quatro e oito dias.*p<0,05. Média de três experimentos.
Figura 14: Efeito do RNAi para daf-16 e skn-1 no número médio de agregados proteicos nos animais vha-54p::Q64::YFP nas fases L4, adulto de quatro e oito dias.*p<0,05. Média de dois experimentos.
59 Figura 15: Efeito do RNAi para daf-16 e skn-1 no número médio de agregados proteicos nos animais vha-54p::Q82::YFP nas fases L4, adulto de quatro e oito dias.*p<0,05. Média de três experimentos.
60