Após os testes sobre o crescimento planctônico de S. mutans, foram testadas a atividade das 3 cepas de Lactobacillus sobre biofilmes formados por S. mutans. Verificou-se que a cepa L. rhamnosus ATCC 7469 não teve efeitos inibitórios sobre o biofilme de S. mutans. Entretanto, as cepas L. rhamnosus ATCC 1465 e L. acidophilus ATCC
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4356 levaram a uma redução de UFC/mL de S. mutans de 77,26 e 15,55%, respectivamente (Figura 5). Controle Interação 0 50 100 150 L. acidophilus 4356 L. rhamnosus 1465 L. rhamnosus 7469 P er cen tu al ( % )
Figura 5 - Percentual de redução de UFC/mL do biofilme de S. mutans para o grupo
controle (S. mutans e solução fisiológica) e grupo interação (S. mutans e cepa de Lactobacillus).
A seguir, os dados de UFC/mL em log10 foram submetidos
à análise estatística, na qual foi verificada redução significativa do biofilme
de S. mutans para a cepa L. rhamnosus ATCC 1465 (Tabela 2 e Figuras
6 a 8).
Tabela 2 - Média e desvio padrão do número de UFC/mL (log10) obtidos a
partir da contagem de S. mutans nos biofilmes do Grupo Controle (S. mutans e solução salina) e Grupo Interação (S. mutans e cepa de Lactobacillus)
Micro-organismo Grupos Media DP Valor max. Valor min. p-valor*
Interação Controle 8,49 0,26 8,71 7,88 L . acidophillus 4356 Interação 8,39 0,31 8,66 7,87 Interação Controle 8,57 0,18 8,96 8,46 L. rhamnosus 1465 Interação 8,01 0,24 8,26 7,44 Interação Controle 7,83 0,21 8,19 7,54 L. rhamnosus 7469 Interação 7,92 0,33 8,32 7,52 0,45 0,0001 0,45 *Valor de p obtido na comparação do grupo controle e Interação.
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Figura 6- Médias e desvio-padrão das reduções de UFC/mL (Log10) obtidas entre o grupo controle de S. mutans e a interação entre S. mutans e L. acidophilus 4356 no
biofilme.
Figura 7- Médias e desvio-padrão das reduções de UFC/mL (Log10) obtidas entre o grupo controle de S. mutans e a interação entre S. mutans e L. rhamnosus 1465 no
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Figura 8 - Médias e desvio-padrão das reduções de UFC/mL (Log10) obtidas entre o grupo controle de S. mutans e a interação entre S. mutans e L. rhamnosus 7469 no
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6 DISCUSSÃO
Atualmente, uma variedade de produtos lácteos contendo diferentes cepas de Lactobacillus está sendo comercializada em países de todo o mundo e estudos têm sido realizados para validar os efeitos positivos de sobrevivência destas bactérias, principalmente no trato gastrointestinal (Parvez et al., 2006; Huovinen, 2001; Carson, 2003).
Os lactobacilos são bactérias comensais que vivem em estreita associação com o organismo humano. A sua capacidade para inibir o crescimento de vários agentes patogênicos ganhou interesse, e eles têm sido utilizados como probióticos no intestino há décadas (Teanpaisan, Piwat, 2014). Esses micro-organismos são estudados principalmente para promover efeitos benéficos sobre o trato gastrointestinal e promover a saúde humana. No entanto, a utilização de probióticos para promover a saúde bucal ainda não está bem esclarecida (Lee, Kim, 2014).
A cárie dentária é considerada uma doença infecciosa induzida por vários fatores. O objeto central do estudo dessa doença, em diversas pesquisas, tem sido Streptococcus mutans (Lin et al., 2015) por apresentar diversos fatores de virulência associados à aderência de superfícies lisas dentárias, propriedade acidúrica e acidogênica, e capacidade em formar polissacarídeos extracelulares (Li et al., 2001; Koo et al., 2010; Cheon et al., 2013; Durso et al., 2014). Apesar da prevalência de cárie ter diminuído nas últimas décadas, devido principalmente à utilização de fluoretos, a doença ainda constitui um problema clínico e por esse motivo novas formas de prevenção tornaram-se necessárias (Simark-Mattsson et al.,2007).
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Os probióticos têm sido utilizados nesse contexto para modificar condições ecológicas dentro do biofilme dentário e dessa forma, prevenir ou reduzir o desenvolvimento de cárie dentária, entretanto os efeitos inibitórios e antimicrobianos sobre S. mutans e sobre o desenvolvimento de cáries permanece contraditório (Matsumoto et al., 2005; Simark-Mattsson et al.,2007; Söderling et al., 2010; Marttinen et al., 2012; Lin et al., 2015; Schwendicke et al., 2014).
No presente estudo foi avaliada a atividade antibacteriana de cepas probióticas de Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus acidophilus sobre S. mutans utilizando modelos de estudo in vitro (forma planctônica e formação de biofilme).
Inicialmente realizamos o teste in vitro da atividade antibacteriana das cepas de Lactobacillus sobre S. mutans na forma planctônica para avaliar a interação direta entre as células desses micro- organismos. Os resultados mostraram que não houve redução significativa entre os grupos controle e o grupo interação (S. mutans e cepa de L. acidophilus).
Em contrapartida, ao avaliar os efeitos antibacterianos in
vitro de cepas de Lactobacillus isoladas de produtos comerciais
alimentícios sobre S. mutans, Lin et al. (2015) demonstraram que todas estas cepas inibiram o crescimento de S. mutans a 108 células/mL; mesma concentração utilizada neste estudo. Estes autores também testaram os filtrados da cultura das cepas de Lactobacillus sobre S.
mutans com pH ajustado a 6.5 e sem ajuste de pH e observaram que os
filtrados de todas as cepas tiveram ação inibitória enquanto apenas os filtrados com pH ajustado a 6.5 de duas cepas foram capazes de inibir o crescimento de S. mutans.
A hipótese demonstrada por esses autores é de que a formação de um ambiente ácido pela produção de possíveis bacteriocinas pode influenciar no desenvolvimento e crescimento de células de S.
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mutans e que esse efeito é dependente da cepa de Lactobacillus
utilizada. Por esse motivo podemos considerar que as cepas de Lactobacillus utilizadas no presente estudo podem não apresentar os mesmos efeitos como demonstrado por Lin et al. (2015), e que estudos sobre a acidogênese dessas cepas se faz necessário.
Neste estudo também avaliamos a ação das cepas de Lactobacillus sobre o biofilme pré-formado de S. mutans. Como na cavidade bucal os micro-organismos apresentam-se comumente organizados em biofilmes, o objetivo deste teste foi identificar uma possível ação probiótica das cepas de Lactobacillus testadas sobre biofilme com adesão inicial de S. mutans de 1:30 h antes da interação com as células de Lactobacillus; partindo do pressuposto do consumo atual de produtos comerciais contendo micro-organismos probióticos como alimentos e bebidas e de um provável biofilme pré-formado na cavidade bucal do indivíduo.
Nossos resultados mostraram que duas das cepas testadas (Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 e Lactobacillus
rhamnosus ATCC 7469) não apresentaram redução significativa sobre
biofilme pré-formado de S. mutans, mas também não contribuíram para o aumento do crescimento do biofilme. Demonstrando que apesar de algumas cepas de Lactobacillus serem consideradas cariogênicas (Badet et al., 2008; Palombo, 2011; Metwalli et al., 2013; Schwendicke et al., 2014) as cepas deste estudo não apresentaram capacidade de participar do desenvolvimento do biofilme.
A cepa de Lactobacillus rhamnosus (ATCC 1465) avaliada no presente estudo apresentou redução significativa (p < 0,0001), mostrando que a cepa possui efeito antimicrobiano sobre biofilme de S. mutans pré-formado. Esta mesma cepa não apresentou efeito inibitório significativo quando no teste planctônico. Frente a estes resultados é possível considerar que esta cepa pode não produzir metabólitos que
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influenciem na multiplicação das células de S. mutans, mas que possivelmente por inibição competitiva esta cepa de Lactobacillus pode ter influenciado no desenvolvimento do biofilme por S. mutans
Em estudo sobre os efeitos imunomoduladores de Lactobacillus rhamnosus ATCC 1465 (Narcizo et al., 2014) os autores avaliaram a influência desta cepa na contagem de leucócitos e nos níveis séricos de IgG em ratos SPF (livres de patógenos específicos) recém desmamados, porém observaram que os animais que consumiram L.
rhamnosus apresentaram média de contagens totais de leucócitos
semelhantes ao grupo controle e não observaram diferença estatisticamente significante entre os grupos estudados em relação aos níveis séricos de IgG. Assim, os resultados sugerem que o consumo de L. rhamnosus não influenciou significativamente na quantidade de células imunes e anticorpos presentes no sangue de ratos SPF recém- desmamados. Entretanto, este estudo sugere um interesse nos possíveis efeitos probióticos dessa cepa.
Apesar de encontrarmos redução estatisticamente significativa na inibição de S. mutans em biofilme por apenas uma das cepas utilizadas no presente estudo, ambas espécies, L. acidophilus e L.
rhamnosus, são frequentemente estudadas e algumas cepas de L.
rhamnosus demonstram reduzir o número e a atividade acidogênica de S.
mutans em estudos (Meurman et al., 1995; Nase et al., 2001; Koll-Klais et al., 2005; Schwendicke et al., 2014). Um exemplo é o estudo de Lee e Kim (2014) em que L. rhamnosus apresentou nível de inibição na formação de biofilme cariogênico mais forte comparado com L. acidophilus e L. casei apesar de não apresentaram diferença significativa quando no teste antibacteriano planctônico, resultado muito semelhante ao da cepa de L. rhamnosus 1465 apresentada neste estudo. Assim como, Ahmed et al. (2014) mostrou que L. acidophilus foi capaz de reduzir
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em ate 80% o gene GtfB, responsável pela maturação e formação do biofilme por S. mutans.
Outros autores, ainda, demonstram efeitos contraditórios
de L. rhamnosus GG sobre S. mutans. Nase et al. (2002) demonstraram o
potencial efeito probiótico de L. rhamnosus GG inibindo crescimento de S. mutans UA 159 em biofilme. Enquanto, Schwendicke et al. (2014) em estudo com dentes bovinos comprovou a cariogenicidade da cepa de L. rhamnosus GG, sendo que essa cepa em biofilme heterogênio com S.
mutans 25175 apresentou cariogenicidade maior quando comparado com
biofilmes monoespécie de S. mutans ou de L. rhamnosus GG.
Por esse motivo, estudos mais aprofundados sobre os mecanismos de ação dessas cepas são necessários para afirmar e validar seus possíveis efeitos probióticos sobre micro-organismos cariogênicos.
Em síntese, a redução de S. mutans por Lactobacillus, em curto prazo, apresentados em diversos estudos e demonstrado também no presente estudo, não pode ser associado diretamente à redução de cárie dentária, devido ao fato de considerarmos que o gênero Lactobacillus são bactérias produtoras de ácido lático e participam do processo de progressão da cárie dentária (Hasslöf et al., 2010; Twetman, Keller, 2012; Holgerson et al., 2013). Dessa forma, estudos com a utilização desses micro-organismos probióticos em longo prazo também são necessários para estabelecer uma utilização clínica segura dessas cepas, assim como garantir seus efeitos benéficos. Além disso, estudos in vivo são importantes para garantir os potenciais efeitos probióticos ou a cariogenicidade dessas cepas na cavidade bucal.
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7 CONCLUSÃO
Conclui-se que as 3 cepas probióticas de Lactobacillus testadas (Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus rhamnosus ATCC 1465 e ATCC 7469) não estimularam o crescimento ou a formação de biofilmes de S. mutans. Além disso, a cepa de Lactobacillus rhamnosus 1465 apresentou efeito inibidor para ser utilizada como método de controle do biofilme bucal de Streptococcus mutans UA 159.
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