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Identificada a sequência peptídica da ORF hipotética e ocorrendo a confirmação de que esta pertence a um operon, ela foi clonada em vetor de expressão para futuros ensaios de complementação em diversas cepas deficientes em reparo de DNA e/ou estresse oxidativo.

A confirmação do sucesso da clonagem se deu através do ensaio de digestão enzimático, no qual pôde se observar a liberação de insertos contendo fragmento de DNA com tamanho esperado das sequências das ORFs clonadas (Figura 7). Entretanto, precisa-se ainda verificar o sentido no qual os genes das ORFs foram expressos. Isso será realizado através de digestão enzimática e análise dos fragmentos liberados.

4. Conclusão

A ferramenta de proteômica mostrou-se bastante eficiente na busca de novos genes que podem ser alvos biotecnológicos. A detecção de uma ORF hipotética que apresenta um domínio desconhecido e o aumento da expressão gênica sob condição de estresse oxidativo apontam para um possível gene com função relacionada ao combate a esse tipo de estresse que ainda não foi caracterizado. Organizada na forma de um operon, adquirido por transferência horizontal no genoma de C. violaceum, esta ORF possivelmente confere uma maior resistência desse organismo ao estresse ambiental. Outros experimentos serão realizados para verificar esta possibilidade.

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112 Legendas

Figura 1. 2D-SDS-PAGE Imagem A: amostras-controle. A seta vermelha aponta o spot “U”, que representa a ORF CV0868. Imagem B: amostras tratadas com 8 mM de peróxido de hidrogênio. A seta vermelha aponta o spot “H”, que representa a ORF CV0868, a qual, por sua vez, aumentou a expressão após o tratamento.

Figura 2. Análise do BLAST da ORF CV0868, detecção de um domínio funcional DUF.

Figura 3. Análise do contexto genômico da ORF CV0868. Figura adapitada de http://www.brgene.lncc.br/cviolaceum/.

Figura 4. Eletroforese em gel de agarose contendo produto da amplificação da reação de RT-PCR com cDNA totais de C. violaceum. PCR A: iniciadores CV0869F e CV0868, amplicom com 833pb. PCR B: iniciadores CV0868F e CV0868R, amplicom com 668. PCR C: iniciadores sodF e sodr2, amplicom com 898 pb.

Figura 5. Alinhamento múltiplo feito utilizando-se a sequência peptídica das ORFs (CV0867 e CV2504) de C. violaceum, ambas codificam para superóxido dismutase de ferro.

Figura 6. A: Árvore filogenética padrão para comparação, construída por verossimilhança utilizando-se sequências nucleotídicas do gene ribossomal 16S. B: Árvore filogenética construída por verossimilhança utilizando-se sequências peptídicas da proteína superóxido dismutase. Claustre 1: membros da família Neisseriales. Claustre 2: evento de transferência horizontal do gene sodB.

Figura 7. Eletroforese em gel de agarose contendo produto da digestão do pGen. A seta aponta para a banda que representa a liberação do inserto.

113

Tabela 1. Parâmetros utilizados nas reaçõess de PCR

Amplicon Região Primer forward Primer reverse Temperatura de anelamento 833 pb CV0868 a CV0869 CV0869F- AGGGTTACGGTTGCCATGT CV0868R- GATTCGGGATGTTCTGGTG 52 ºC 668 pb CV0868 a CV0869 CV0868F- GGCGATTTTTATTTTTATCCGTTAT CV0868R- GATTCGGGATGTTCTGGTG 55 ºC 898 pb ORF CV0867 sodF- CACCAGAACATCCCGAATC sodr2- TCCAGGTAGTAGGCGTGCTC 56 ºC

114

Tabela 2. Número de acesso das sequencias utilizadas na análise

Organismo _{RNA ribossômico 16S} Número de acesso _{Proteína Sod}

Acidovorax avenae AF078761.1 NP_288092.1 Actinobacillus minor NR_042869.1 ZP_03611962.1 Agrobacterium tumefaciens AE007870.2 NP_356077.2 Bordetella parapertussis BX640447.1 NP_883101.1 Bacillus subtilis AL009126.3 ZP_06875792.1 Burkholderia sp. CP002520.1 YP_370112.1 Caulobacter crescentus CP001340.1 NP_420585.1 Chlorobium ferrooxidans Y18253.1 ZP_01385691.1 Chlorobium limicola CP001097.1 YP_001943146.1 Candidatus Methanoregula boonei EU887810.1 YP_001404875.1 Chromohalobacter salexigens HE662816 YP_573912.1 Chlorobium tepidum NR_044685.1 NP_662101.1 Chlamydia trachomatis HE601795.1 ZP_05380662. Chromobacterium violaceum AE016825.1 AAQ58542.1

AAQ60175.1

Desulfomicrobium baculatum NR_042019.1 ACU90151.1 Desulfovibrio fructosovorans NR_028699.1 ZP_07332303.1 Desulfotalea psychrophila NR_028729.1 YP_064052.1 Deinococcus radiodurans AE000513.1 NP_295003.1 Echerichia coli AY616658.1 NP_288092.1 Halogeometricum borinquense CP001690.1 YP_004036465.1 Methanosarcina barkeri CP000099.1 YP_307037.1 Methylococcus capsulatus X72771.1 YP_114498.1 Maricaulis maris AJ227803.1 YP_757125.1 Mycobacterium tuberculosis GU142936.1 NP_218363.1 Myxococcus xanthus CP000113.1 YP_632987. Nitrosomonas eutropha NR_027566.1 ABI59459.1 Neisseira gonorrhoeae AE004969.1 ZP_06130665.1 Neisseria meningitidis GU561416.1 YP_002342508.1 Nitrosospira multiformis CP000103.1 ABB73809.1 Oceanicaulis alexandrii AJ309863.1 ZP_00952192.1 Oscillatoria sp AY768397.1 CBN57719.1 Pyrobaculum aerophilum AE009441.1 NP_558493.1 Pseudomonas aeruginosa HM142820.1 NP_253056.1 Pelodictyon phaeoclathratiforme NR_044914.1 YP_002018405.1 Rickettsia rickettsii CP003318.1 P_001494799.1 Sulfolobus acidocaldarius NR_043400.1 YP_254907.1 Synechococcus elongatus AP008231.1 YP_171447.1 Syntrophobacter fumaroxidans NR_027598.1 YP_847525.1 Thermoplasma acidophilum NR_028235.1 NP_393491.1 Xanthomonas axonopodis AE008923.1 NP_642702.1 Xylella fastidiosa AE008923.1 NP_642702.1

115

Tabela 3. Identificação das proteínas diferencialmente expressas em C. violaceum ATCC em resposta ao peróxido de hidrogênio. Spot “H” e o “U” codifica uma ORF hipotética a CV0868.

N da placa Spot N° MW / pI (kDa) Method (PMF and/or MS/MS) Protein Score/ Ion Score No. peptides matched (PMF) Sequence coverage (%) Parental Ions

Sequences of all identified peptides

ID (NCBI) Protein description Experimental Teórico

F8 T 26.7/5.0 PMF 79/- 13 57 - - gi|150019504 Nucleotidyl transferase [Clostridium beijerinckii

NCIMB 8052]

F10 U 16.4/6.6 PMF-

MS/MS

125/50 7 2231.22 AVITQALQHPLIFENPVQGR gi|34496323 hypothetical protein CV_0868 [Chromobacterium violaceum ATCC 12472]

F14 A 55.5/5.1 PMF 78/- 18 48 - - gi|163728925 fused D-ribose

transporter subunits of ABC superfamily: ATP- binding component [Vibrio fischeri MJ11]

G2 3 66.6/9.0 PMF 85/- 22 - - gi|42523570 hypthetical protein

[Bdellovibrio bacteriovorus HD100] G3 H 16.4/6.6 PMF- MS/MS 322/219 9 1886.92 2231.22 2837.35 YEEKGGDIELFLNGFR AVITQALQHPLIFENPVQGR YAFLQAGHWVEEFGQDIQLSDEVR

gi|34496323 hypothetical protein CV_0868 [Chromobacterium violaceum ATCC 12472]

G11 M 11.7/5.6 PMF 81/- 12 - - gi|41400047 outer surface protein A

116

Figura 1. Duarte et al.

Control

B - Tratamento com 8 mM H

O

pH 3.0

IEF

pH 10.0

A - Controle

pH 3.0

IEF

pH 10.0

117 Figura 2. Duarte et al.

118 Figura 3. Duarte et al.

119 Figura 4. Duarte et al.

PCR A PCR B PCR C CV0869 hp CV0868 hp CV0867/sod (833 bp) (668 bp) (898 bp) PCR A PCR B PCR C 250 - 500 - 750 - 1000 - bp

120 Figura 5. Duarte et al.

121 Figura 6A. Duarte et al.

122 Figura 6B. Duarte et al.

123 Figura 7. Duarte et al.

124