Hikaye Anlatıcılığı: Dil Yaratmak yahut Kalıplaşmak

2.1. Linhagens bacterianas, condições de cultivo e tratamento

A linhagem bacteriana usada neste estudo foi a Chromobacterium violaceum ATCC 12472, mesma linhagem usada no Projeto Genoma Brasileiro. Colônias foram selecionadas em placas de Petri e incubadas em 5 mL meio Luria-Bertani (LB), sem antibiótico, a 28 ºC e 200 RPM aerobicamente por toda a noite. Após esse período, as amostras foram diluídas na proporção de 1:10 em meio LB fresco, chegando ao volume total de 50 mL, e incubadas por 2 horas a 28 ºC e 200 RPM na presença ou na ausência de 8 mM de H2O2.

2.2. Extração de proteínas

Após a exposição ao peróxido de hidrogênio, as culturas foram centrifugadas por 10 minutos a 5.000 RPM em 4 ºC. O precipitado foi lavado com 50 mL de solução Tris-HCl, 10 mM e pH 7,4 e novamente centrifugado nas mesmas condições já descritas. Em seguida, as amostras foram ressuspendidas em 1 mL de solução solubilizadora contendo 100mM de Tris-HCl com pH 8,0 e 1% de Triton-X100. A concentração de proteína foi determinada segundo o método de Bradford (1976), utilizando-se o kit de ensaio de proteína da Bio-Rad com BSA (albumina do soro bovino) como proteína padrão.

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2.3. Eletroforese bi-dimensional (2-DE)

Este ensaio foi realizado utilizando os reagentes GE. Para a focagem isoelétrica, utilizaram-se strips GE de 13 cm com gradiente de imobilização de pH entre 3-10 linear. Os strips foram reidratados por 16 horas com 250 µL IEF buffer contendo 250 µg de proteína solubilizada. Essas proteínas foram separadas usando o Multiphor II eletroforese (Amersham Bioscences) sob as seguintes condições: primeira etapa, retenção 500 V por 1 hora, segunda gradiente 1000 V por 1 hora, terceira gradiente 8000 por 2 horas e 40 minutos, totalizando 14,0-17,0 kVh.

2.3.1. SDS-PAGE

Após executar a primeira dimensão, os strips foram colocados em uma solução de 10% de DTT por 15 minutos e, em seguida, equilibrados pelo mesmo tempo em 10 ml tampão com 6 M de ureia; 75 mM de Tris-HCl com pH 8,8; 29,3% de glicerol; 2% de SDS; 0,002% de bromofenol blue; e 2,5% de iodoacetamida. Logo após, foram colocados em um gel com 12,5% de acrilamida. A segunda dimensão (SDS-PAGE) foi realizada em cuba eletroforética vertical. Obedeceu-se às seguintes condições: primeira etapa, 500 volts constantes durante 1 hora; segundo passo, 1000 volts constantes por 1 hora; e, por fim, 8.000 volts por 1,5 hora.

2.3.2. Coloração do gel e análise de dados

Após a corrida eletroforética, as proteínas foram fixadas com solução de etanol (EtOH): Ácido acético (HOAc): H2O (4:1:5 v/v/v), por toda a noite e, logo após, as proteínas foram sensibilizadas por 30 minutos com a solução (EtOH, 5% de tiosulfato de sódio e acetato de sódio), coradas com solução de AgNO3 e reveladas com solução de carbonato de sódio. Após a coloração, os géis tiveram suas imagens digitalizadas pelo scanner ImageScanner (GE Healthcare), usando-se o software ImageMasterTM _{2D Elite.}

2.4. Digestão enzimática das proteínas no gel

Os spots que apresentaram expressão diferencial foram excisados do gel com o auxílio de uma ponteira cortada na ponta e colocados em microtubos. Logo após, para descorar os pedaços de gel, foram lavados 3X por 15 minutos com 400 µL de solução de 30 mM de ferrocianeto de potássio e de 100 mM de tiosulfato de sódio.

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Em seguida, os pedacinhos de gel foram saturados com 200 µL de ACN por 5 minutos.

Para a digestão dos peptídeos, o gel foi reidratado com tripsina (sequencing- grade modified trypsin - Promega, Madison) diluída em bicarbonato de amônio 50 mM (concentração final 20 ng/µL) e incubada por 16-24 h a 37°C.

2.5. Identificação de proteínas por MALDI-TOF-TOF-MS

Esses peptídeos foram identificados por análise MALDI-TOF-TOF-MS, a qual foi realizada por um espectrômetro (ABI 4700 Proteomics Analyzer -Applied Biosystems) utilizando-se 3,5-dimetoxi-4-hydroxycinnamic ácido como matriz. Os dados obtidos foram analisados usando-se o software GPS Explorer™ (Applied Biosystems). Os espectros de massas detectados foram submetidos à análise do MASCOT (versão 1.8.0, Matrix Science, Ltd., Londres, Reino Unido) utilizando-se proteínas do banco de dados de Chromobacterium violaceum no NCBI.

2.6. Extração e purificação do DNA total de C. violaceum

1,5 mL de cultura de C. violaceum crescida em meio LB por toda a noite a 28 ºC e agitação de 200 RPM foi centrifugada a 12.000 RPM por 3 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em 200 µL tampão de lise (40 mM de tris-acetato, 20 mM acetato de sódio, 1 mM de EDTA, 1% de SDS). Em seguida, foram adicionados 66 L de NaCl a 5 M e agitados fortemente. Novamente a solução foi levada à centrífuga a 12.000 RPM durante 10 min a 4 ºC. O sobrenadante foi transferido para novo tubo, ao qual se adicionaram 266 µL de clorofórmio, e centrifugado mais uma vez por 12.000 RPM durante 3 min a 4 ºC. O sobrenadante foi recuperado e os ácidos nucleicos foram precipitados com etanol gelado a 100% e mais um ciclo de centrifugação. O precipitado foi lavado com etanol 70%, ressuspendido em 50 l de TE com 20 uL de RNAse e estocado a -20 ºC.

2.7. Extração de DNA plasmidial

A extração de DNA plasmidial de E.coli foi feita segundo Sambrook e Russell, (2001) com modificações. Cepas de E. coli contendo os plasmídeos de interesse foram cultivadas por toda noite em 2 mL de meio LB adicionado 100 µg de

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ampicilina. A cultura foi transferida para tubos plásticos de 2 mL, e as células foram coletadas por centrifugação (14.000 RPM, 5 minuto) e ressuspensas em 150 L da solução P1 (Tris.HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 10 mM, 100 µg/mL de RNase). Para lise bacteriana, foram adicionados 150 L de solução P2 (NaOH 200 mM e SDS 1% (m/V)). As proteínas, o DNA cromossômico, os restos celulares e o SDS foram precipitados pela adição de 150 L da solução P3 (acetato de potássio 5 mM pH 5,5) e pela incubação por 10 minutos em gelo. As amostras foram, então, centrifugadas (14.000 RPM por 15 minutos a 4 ºC), e o sobrenadante coletado. Foram utilizados 400 µL de isopropanol para precipitar os DNA plasmidial. Em seguida, o precitado foi lavado com etanol 70% e, mais uma vez, centrifugado. O pelet foi ressuspendido em 40 µL de TE e estocado a -20 ºC.

2.8. Eletroforese de DNA total e plasmidial

A eletroforese de DNA foi feita em gel horizontal de agarose a 0,7 %, como descrito por Sambrook e Russell, (2001). O tampão utilizado foi TAE 1X (Tris-acetato 40 mM e EDTA 1 mM pH 8,0). O DNA foi visualizado em transluminador de luz ultravioleta na presença (0,5 g/mL) de brometo de etídeo.

2.9. Competência bacteriana

5 mL de uma cultura saturada de E. coli DH10B foram inoculados em Erlenmeyer de 2 L contendo 250 mL de meio LB fresco incubados a 37 ºC e 200 RPM. A cultura cresceu até atingir uma D.O.600 de _{≅ 0,8. As células foram} coletadas por centrifugação (4.000 RPM por 15 minutos, a 4°C) e lavadas duas vezes com água estéril (4 °C). Em seguida, foram ressuspensas em glicerol 10% (4 °C), centrifugadas novamente nas mesmas condições e, por fim, ressuspensas em um volume final de 750 µL de glicerol 10% (4 °C). Foram aliquotadas em 55 µL e armazenadas a -80 °C. As células foram mantidas constantemente em refrigeração em gelo por todo o procedimento baseado em Shigekawa e Dower (1988).

2.10. Extração de RNA totais de C. violaceum e síntese de cDNA

Colônias de C. violaceum foram cultivadas nas condições já descritas anteriormente. Em seguida, foram utilizados 2 mL dessas colônias para a extração e purificação de RNA total usando-se o kit da GE RNAspin Mini Isolation, seguindo

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orientações de fabricante. Esse kit recupera o RNA total com alta qualidade, removendo o DNA genômico através de colunas tratadas com DNAseI.

Uma vez extraído o RNA, foram sintetizados cDNA totais com iniciadores randômicos utilizando-se o kit High capacity cDNA reverse transcription, da Applied Biosystems, seguindo normas do fabricante.

2.11. Reação de polimerase em cadeia

A reações de PCR foram realizadas visando obter produtos para clonagem utilizando-se DNA totais e, nas reações RT-PCR, foram usados cDNAs totais.

Para obtenção da sequência específica, foram desenhados iniciadores utilizando-se o programa Primer3 (Rozen e Skaletsky, 2000). Todos os reagentes usados nas reações de PCR são oriundos da Invitrogen. A reação continha os seguintes reagentes: 2,5 µL de10X PCR Rxn buffer; 1,25 µL de 50 mM MgCl2; 0,5 de 10 mM dNTP mix; 0,5 µL cada primer específico “forward” e “reverse” (Tabela 1), 0,2 de Taq DNA polymerase, Recombinant; 1 µl de amostra de cDNA totais e 18,5 µL de H2O Milli-Q, tendo um volume final de 25 µL. Os controles negativos continham apenas água Milli-Q em vez de cDNA. Em seguida, a reação foi submetida a um termociclador, obedecendo-se aos seguintes passos: 35 ciclos de desnaturação, anelamento com temperatura específica ao primer (Tabela 1), extensão (96 ºC/1 min, 1 min,72 ºC /1 min, respectivamente) e uma extensão final a 72 ºC por 10 minutos.

2.12. Clonagem das ORFs

As ORFs CV0867, CV0868 e CV0869 foram amplificadas por PCR e precipitadas em glicogênio para purificação. Em seguida, os produtos de PCR de cada ORF foram ligados no sistema de vetor pGEM®-T Easy (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Foram utilizados 5 µL de tampão de ligação 2X (Promega), 4 µL do vetor pGEM®-T Easy (50 ng), 10 µL de cada ORF amplificada por PCR (uma amostra por reação), 1 µL de enzima T4 DNA Ligase (Promega) e 5 µL de água Milli-Q autoclavada. As amostras dos tubos foram misturadas com pipeta e a reação ficou a 16 °C por 18 horas.

As ligações em um volume 3 µL foram inseridas em tubos contendo 55 µL de bactéria competente e realizada a eletroporação (1800 V). Em seguida, os

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transformantes foram inoculados em 2 mL de meio LB líquido por uma hora. Essas amostras foram plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina (1:100) e X-gal para seleção de colônias com inserto. Após 24 horas de incubação em estufa a 37 ºC, as colônias brancas foram inoculadas em 2 mL de meio LB líquido por 18 horas.

Os plasmídeos dos clones foram extraídos através de minipreparação, de acordo com Sambrook e Russell (2001). Posteriormente, os plasmídeos foram digeridos com enzima de restrição EcoRI para verificação dos insertos.

2.13. Análise filogenética

As análises filogenéticas foram realizadas utilizando a plataforma de análise programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis versão 5.05) (Kumar et al., 2008). Os alinhamentos globais foram feitos utilizando algoritmo do ClustalW (Thompson et al., 1997). Foi selecionado o melhor modelo de substituição de acordo com os dados a serem analisados. As filogenias foram inferidas pelo método da máxima verossimilhança (MV), e o nível de confiança atribuído nos diferentes ramos foi determinado por replicações de bootstrap com 100 réplicas (Felsenstein, 1985). As sequências peptídicas da proteína superóxido dismutase foram adquiridas no banco público disponibilizado pelo NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), e os números de acesso estão disponíveis na Tabela 2.

3. Resultados preliminares e discussão