5.3.2.1 Aspiração intra-folicular, seleção e classificação dos oócitos
Os ovários utilizados para a realização do presente Experimento foram obtidos de abatedouros e transportados em solução salina 0,9% estéril, suplementada com antibiótico, em recipiente térmico a 35ºC. No laboratório, 2 a 3 horas passadas do abate, os ovários foram borrifados com álcool 70% e lavados duas vezes em solução fisiológica aquecida (35ºC), suplementada com soro fetal bovino (SFB) e antibiótico. Em seguida, foi realizada a aspiração dos folículos de 2 a 7 mm com auxílio de agulha de calibre 18G acoplada a uma seringa de 10 mL. O conteúdo folicular recuperado foi despejado em um tubo cônico de 50 mL mantido em banho-maria. Após todos os ovários terem sido submetidos ao processo de aspiração intra- folicular, o conteúdo folicular obtido foi filtrado, lavado com a mesma solução fisiológica suplementada acima mencionada e depositado em uma placa de cultivo celular de 60 x 15 mm (Corning®). As placas foram então levadas para o fluxo laminar para que a procura dos oócitos fosse realizada sob estereomicroscópio.
Somente oócitos grau I e II foram utilizados no presente experimento. Oócitos atrésicos, apresentando cumulus expandido, ausência de células do cumulus (desnudos) ou citoplasma muito escuro, muito claro ou com grânulos foram descartados.
Em seguida, os oócitos selecionados foram lavados duas vezes no meio TCM199 com sais de Earles, glutamina, NaHCO3 e Hepes (GibcoTM, Cat. Nº.12350- 039) suplementado com piruvato (22 μg/mL), antibiótico (8,3 mg/mL), e 10% de SFB (GibcoTM Cat. Nº. 10270-106), denominado meio de lavagem (H199+).
5.3.2.2 Separação dos grupos
Logo após a seleção, os complexos cumulus-oócito (CCO) foram homogeneamente separados em quatro grupos (Controle 8h, Antioxidante 8h,
Controle 20h e Antioxidante 20h), contendo aproximadamente 50 CCO cada, sendo mantida a mesma proporção de oócitos grau I e II em cada grupo. Os CCO foram transferidos para tubos de poliestireno de 1,5 mL, contendo 1,0 mL de meio H199+ com ou sem antioxidante (Trolox®), da seguinte forma:
- Grupo Controle 8h (GC8h): 50 CCO + 1,0 mL de H199+;
- Grupo Antioxidante 8h (GA8h): 50 CCO + 1,0mL de H199+ + antioxidante; - Grupo Controle 20h (GC20h): 50 CCO + 1,0 mL de H199+;
- GrupoAntioxidante20h(GA20h):50CCO+1,0mLdeH199+ + antioxidante.
Os tubos referentes aos quatro grupos foram devidamente identificados e mantidos em uma transportadora de oócitos (Mini Tub), com temperatura constante de 37ºC, por 8 (GC8h e GA8h) ou 20 horas (GC20h e GA20h). Esse sistema estaria simulando o transporte de oócitos do campo para o laboratório após aspiração intra- folicular in vivo, com diferentes períodos de transporte (8 e 20h).
5.3.2.3 Maturação in vitro de Embriões
Passado o período de transporte, os CCO foram removidos dos tubos e lavados duas vezes em gotas de TCM199 com sais de Earles, glutamina e NaHCO3 (GibcoTM, Cat. Nº. 11150-059) suplementado com 10% de SFB (Cat. Nº. 16140), piruvato (22 μg/mL), antibiótico (8,3 mg/mL), 0,5 μg de FSH/mL, 50 μg de LH/mL e 1 μg de estradiol/mL (Sigma Cat. Nº. E-8875), denominado meio de maturação (B199+). Os CCO foram, então, transferidos para migrogotas de 70 μL de B199+, cobertas com óleo mineral (Sigma, Cat. Nº. M-8410) em placas de cultivo celular (Fig. 5). Aproximadamente 25 CCO foram colocados em cada microgota e levados à incubadora a 38,5 – 38,8ºC e 5% de CO2 em atmosfera com umidade saturada até
completar 24 horas de maturação (16 horas e 4 horas para os grupos 8h e 20h, respectivamente).
35 µL meio + 3,5 mL óleo + 35 µL meio + 10
µL oócitos
Figura 5. Esquema de montagem de placas de maturação in vitro de complexos
cumulus-oócitos.
5.3.2.4 Fecundação in vitro de Embriões a-) Preparação dos oócitos
Após o período de maturação, os oócitos foram lavados em meio TALP suplementado com heparina (10 μg/mL), piruvato (22 μg/mL), antibiótico (0,5 mg/mL), BSA livre de ácidos graxos (6 mg/mL) e solução PHE (2 μM de penicilamina, 1 μM de hipotaurina e 0,25 μM de epinefrina), denominado meio FIV.
b-) Preparo dos espermatozóides e inseminação in vitro
As palhetas de sêmen de 0,25 mL de um único touro e única partida (Lagoa da Serra Ltda) foram descongeladas em banho-maria a 35ºC, durante 30 segundos e seu conteúdo submetido à técnica de gradiente de Percoll (PercollTM, GE Heathcare Bio- Sciences AB, Cat. No. 17-0891-01) para a obtenção dos espermatozóides móveis e remoção do diluidor e do plasma seminal (Fig. 6). Para tanto, o gradiente de Percoll (45 e 90%) previamente preparado com TALP-SPERM e equilibrado em estufa, teve o sêmen de uma palheta depositado sobre ele e foi submetido à centrifugação (320G) por 30 minutos. Terminada a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet avaliado quanto ao volume (μL), concentração e motilidade espermática, retirando-se, para isto, duas alíquotas 5 μL, as quais foram diluídas em 250 μl de água e 250 μl de meio FIV, respectivamente. O volume de meio FIV que deveria ser adicionado ao pellet (diluição) foi calculado e o sêmen devidamente
diluído, a fim de que cada 10 μL de sêmen contivesse o equivalente a 2 x 106 de
espermatozóides. Após a adição de 10 μL de sêmen em cada microgota de meio FIV contendo aproximadamente 25 oócitos, foi realizada a incubação de espermatozóide e oócito a 38,5-38,8ºC e 5% de CO2 em atmosfera com umidade saturada por 18 a
22 horas.
Percoll 90%
Centrífuga Diluente do sêmen
SPTZ mortos SPTZ viáveis Sêmen
Percoll 45%
Figura 6. Esquema de montagem do tubo de gradiente de Percoll para centrifugação do sêmen a ser utilizado na fecundação in vitro de oócitos.
5.3.2.5 Cultivo in vitro de Embriões
Passado o período de incubação pós FIV, os supostos zigotos foram lavados em 5 microgotas de meio CR4 (meio de cultivo) e o excesso de células do cumulus
foi removido. Posteriormente, foram depositados em microgotas de 50 μL de CR4
cobertas por óleo mineral (Sigma, Cat. Nº. M-8410; Fig. 7).
No terceiro dia de cultivo (D3) foi realizada a avaliação e contagem dos embriões clivados (taxa de clivagem) e o feeding, ou seja, remoção de aproximadamente 30 μL de meio e adição de 40 μL de meio CR4 novo.
Nos sexto, sétimo e nono dias de cultivo (D6, D7 e D9) foram realizadas avaliações e contagens do número de embriões em cada estágio de desenvolvimento embrionário (mórula compacta - Mo, blastocisto inicial - Bi, blastocisto - Bl, blastocisto expandido - Bx, blastocisto eclodindo - Bn, blastocisto
eclodido - Be e blastocisto regredido - Br). No décimo primeiro dia de cultivo (D11) foi realizada a avaliação e contagem apenas dos blastocistos eclodidos - Be.
25 µL meio + 3,5 mL óleo + 25 µL meio + 10
µL embriões
Figura 7. Esquema de montagem de placas de cultivo in vitro de embriões.
5.3.3 Procedimentos Laboratoriais para dosagem de Capacidade