As fêmeas repetidoras de serviço têm considerável impacto na economia de fazendas comerciais de leite (LAFI & KANEENE, 1992) e são normalmente definidas como animais que requerem três ou mais serviços antes de tornarem-se prenhes. Esses animais são caracterizados pelas baixas taxas de fertilização (GRADEN et al., 1968; O’FARRELL et al., 1983) e/ou mortalidade embrionária precoce (LINARES, 1981; GUSTAFSSON & LARSSON, 1985). BÅGE et al. (2001) verificaram que novilhas repetidoras de serviço apresentaram duração prolongada do estro, folículo pré-ovultatório duradouro, atraso no pico de LH, forte tendência de níveis suprabasais de progesterona no período que antecede a ovulação e aumento tardio da progesterona no diestro. Uma assincronia hormonal ao redor do estro tem sido registrada em novilhas repetidoras de serviço que apresentam níveis de progesterona de aproximadamente 0,5-1,0 nmol/L (excedendo concentrações basais normais de 0,5 nmol/L) e emergência de pico pré-ovulatório de LH tardio (GUSTAFSSON et al., 1986; ALBIHN et al., 1991). A desregulação endócrina entre o concepto e o ambiente tanto no oviduto quanto no útero resultando em morte embrionária precoce, pode ser explicada pela fertilidade prejudicada em novilhas repetidoras de serviço (ALBIHN et al., 1989; ALBIHN et al., 1991). A transferência de embrião é uma ferramenta potencialmente utilizada para minimizar os efeitos do ambiente uterino sobre o desenvolvimento embrionário inicial (durante os sete
primeiros dias), promovendo maiores taxas de concepção evitando dessa forma a mortalidade embrionária precoce.
3 HIPÓTESE
3.1 Experimento 1
O antioxidante (Trolox®) adicionado ao meio de manutenção (solução TQC holding) de embriões bovinos produzidos in vivo atuaria neutralizando as ROS produzidas, reduzindo seus efeitos deletérios sobre os embriões e, consequentemente, aumentando as taxas de concepção após a TE para receptoras bovinas repetidoras de serviço da raça Holandesa (Bos taurus taurus).
3.2 Experimento 2
O antioxidante (Trolox®) adicionado ao meio de transporte (H199+) de oócitos bovinos obtidos por aspiração intra-folicular de ovários provenientes de abatedouros atuaria neutralizando as ROS produzidas, reduzindo seus efeitos deletérios sobre os oócitos e, consequentemente, aumentando as taxas de clivagem, blastocisto (D6, D7 e D9) e de eclosão (D11) durante a produção in vitro de embriões. Esse efeito seria ainda mais evidente quanto utilizado em um período de transporte mais extenso (20h).
4 OBJETIVOS
4.1 Experimento 1
Avaliar o efeito da adição de antioxidante (Trolox®) ao meio de manutenção (TQC Holding Plus) de embriões bovinos produzidos in vivo sobre a taxa de concepção após a transferência de embriões para receptoras bovinas repetidoras de serviço da raça Holandesa (Bos taurus taurus).
4.2 Experimento 2
Avaliar o efeito da adição de antioxidante (Trolox®) ao meio de transporte (H199+) de oócitos bovinos obtidos por aspiração intra-folicular de ovários provenientes de abatedouros sobre as taxas de clivagem, blastocisto (D6, D7 e D9) e de eclosão (D11) durante a produção in vitro de embriões.
Avaliar o consumo (eficiência de neutralização de ROS) do antioxidante (Trolox®) adicionado ao meio de transporte (H199+) de oócitos bovinos obtidos por aspiração intra-folicular de ovários provenientes de abatedouros (capacidade antioxidante total).
5 MATERIAL E MÉTODOS
O presente projeto foi composto por dois experimentos: um envolvendo a tecnologia de transferência de embriões – TE (Experimento 1) e outro envolvendo a produção in vitro de embriões - PIV (Experimento 2).
5.1 Antioxidante
5.1.1 Escolha do Antioxidante
O antioxidante escolhido para o presente projeto foi o 6-hidroxi-2,5,7,8 tetrametil croman-2-ácido carboxílico (Trolox®1), um análogo hidrossolúvel da vitamina E. A escolha se baseou no fato de o Trolox poder ter vantagem sobre antioxidantes apenas lipossolúveis, como a vitamina E. Dessa forma, o Trolox® poderia ser distribuído em ambas as fases da bicamada de lipídios das biomembranas, tornando-se um excelente protetor contra a lipoperoxidação, além de poder atingir o meio celular interno e, supostamente, ser incorporado pela célula.
5.1.2 Definição da dose do Antioxidante
A dose de Trolox® definida para uso em meio de manutenção de embriões, TQC Holding Plus2 e posterior inovulação a fresco desses embriões foi de 400
μmol.L-1. Para sua determinação, foram realizadas pesquisas em artigos científicos
divulgados (WANG et al., 2002 e Feugang et al., 2004) e consultas ao Prof. Dr. Antônio Cláudio Tedesco, do Departamente de Química da Universidade de São Paulo, Câmpus de Ribeirão Preto.
5.1.3 Pesagem e Armazenagem das Alíquotas de Antioxidante Para se atingir a concentração desejada do antioxidante (0,1mg/mL), foi realizada a pesagem do produto (1,0 mg ou 0,5mg) em pó adquirido no mercado 1Acros Organics, New Jersey, USA
diretamente em tubos cônicos de 1,5 mL, com auxílio de uma balança digital de alta precisão. Essas alíquotas foram armazenadas em uma caixa protegidas da luz, calor e umidade até o momento do uso, quanto seriam diluídas em 10 ou 5 mL de meio, respectivamente. As pesagens foram realizadas no Laboratório de Reprodução Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Câmpus de Jaboticabal.
5.1.4 Teste de Solubilidade do Antioxidante
O teste de solubilidade do antioxidante (Trolox®) foi realizado no Departamento de Química da Universidade de São Paulo, Câmpus de Ribeirão Preto. Para a realização do teste foram utilizados tubos cônicos de 1,5 mL contendo 1,0 mg de antioxidante previamente aliquotado, seringa, agulha, meio de manutenção de embriões – TQC Holding Plus, vórtex e banho-maria. Uma diluição inicial foi realizada adicionando-se 1,0 mL de meio ao conteúdo do tubo cônico, sendo, posteriormente, realizada a diluição final com mais 9 mL de meio, a fim de se completar 10 mL.
Devido à grande dificuldade de diluição do antioxidante pó tanto no meio de manutenção dos embriões produzidos in vivo quanto no meio de transporte dos oócitos que passariam pela produção in vitro de embriões, foi realizada, na empresa VITROGEN Pesquisa e Desenvolvimento em Biotecnologia da Reproducao S/C Ltda, a diluição prévia do antioxidante em etanol 95%. Nesse caso, no momento do uso, a diluição inicial foi realizada adicionando-se 4,0 μL de etanol 95% ao conteúdo do tubo cônico (0,5 mg de Trolox®), sendo, posteriormente, realizada a diluição final com meio de transporte (H199+3), a fim de se completar 5 mL de uma solução final
de 400 μmol.L-1.
5.1.5 Preparo do Antioxidante
Na fase de campo (Experimento1), imediatamente anterior a cada uso, a diluição do antioxidante foi realizada, adicionando-se 1,0 mL de meio de manutenção
- TQC Holding Plus ao conteúdo do tubo cônico e procedendo-se passagens consecutivas e alternadas por vórtex e banho-maria a 39ºC até a completa diluição. Posteriormente, a solução obtida foi transferida para um tubo cônico de polietileno de 15 mL, onde foi realizada a diluição final com mais 9,0 mL de meio, a fim de se completar os 10 mL finais. Então, a solução foi homogeneizada e aspirada em uma seringa de 20 mL, onde foi mantida protegida da luz e calor até o momento do uso.
Na fase laboratorial (Experimento 2), no dia do uso, a diluição inicial foi realizada adicionando-se 4,0 μL de etanol 95% ao tubo cônico contendo 0,5 mg de Trolox®, sendo, posteriormente, realizada a diluição final com meio de transporte (H199+4), a fim de se completar 5 mL de uma solução final de 400 μmol.L-1. A solução era, então, homogeinizada e mantida em estufa até o momento da sua utilização.