ETKİLERİ
Biyolojik sistemlerde serbest radikaller ile enzimatik ve non-enzimatik
antioksidan savunma sistemleri arasında bir denge bulunmaktadır.
Diğer bir ifade ile bu sistemlerde oluşan serbest radikaller ile bunları temizleme kapasitesine sahip antioksidanlar arasında var olan dengenin bozulmasına oksidatif stres denir. Eğer mevcut denge serbest radikaller lehine bozulur ise oksidatif stres meydana gelir. Bu stres durumu ise çok sayıda patolojik problemlere neden olabilir (Kahraman ve ark. 2003). Yapılan çalışmalar neticesinde oksidatif stresin doğal bir süreç olduğu anlaşılmaktadır. Bu durum, oksijen alan bütün canlılarda, değişik basamaklarda meydana geldiği görülmektedir. Organizmalar, oluşan bu stresi kontrol edebilmek için kendilerine özgü mekanizmalar geliştirmişlerdir. Oluşturulan kontrol mekanizmalarının yetersiz kalması oksidatif hasar yol açabilir.
Hücrelerin canlılıklarını sürdürebilmeleri için belirli bir düzeyde serbest radikale ihtiyaç duydukları bilimsel çalışmalarla tespit edilmiştir. Diğer taraftan aşırı ROT üretimi hücrelerde çok sayıda
145 yapılmış bazı çalışmalarda hücrelerin faaliyetlerini sürdürebilmeleri için belirli düzeyde protein ve lipit oksidasyonunun faydalı olduğu ‘pozitif oksidatif stres’ terimi ile ifade edilmektedir (Yan 2014). Dolayısıyla oksidasyon ürünleri belirli düzeyde oksidatif stresin bir neticesi olarak ortaya çıkmakla beraber oksidatif hasarın ve hücre ölümlerinin genel sebepleri arasında yer almaktadır.
Değişik sebeplerle hücre içerisinde ROT’un artışı kaydedilirse veya antioksidanların bu radikallerle başedemeyecek derecede azalması söz konusu ise oksidatif dengede bir bozulma meydana gelir (Sies 1991). ROT miktarında meydan gelen bu artış neticesinde hücrelerin membranlarında hasarlar, hücre içi proteinlerin yapıları ve fonksiyonlarında bozulmalar oluşabilir. Aynı zamanda DNA’da değişik
boyutlarda yapısal hasarlar oluşturarak hücresel birtakım
zedelenmelere neden olabilirler.
4.1. Oksidatif Stresin Değerlendirilme Yöntemleri
Değişik ölçüm metodları ile oksidatif stres değerlendirilebilir.
1. Serbest radikallerin seviyelerini değerlendirmek.
2. Enzimatik antioksidanların aktivasyonu değerlendirmek.
3. Serbest radikal üretimi nedeniyle meydana gelen lipit, protein ve
146 ÖN LİSANS TOKSİKOLOJİ KİTABI I. CİLT
4.2. Oksidatif Stresin Hücresel Lipit Yapıları Üzerine Etkisi ve Lipit Peroksidasyonu
ROT hasarına karşı lipitler çok hassas yapıdadırlar. Dolayısıyla
oksidatif stresin asıl değerlendirme metodlarından biride hücre
membranındaki lipit peroksidasyon düzeyinin belirlenmesidir. Lipitler
peroksidasyon durumunda çeşitli oksidatif ürünlere ayrışırlar. Bunlar
arasında lipit hidroperoksidaz (konjuge çift bağlar), melondialdehit
(MDA), ekshale edilen pentan, heksan ve ethan bulunmaktadır. En sık
başvurulan oksidatif stres parametreleri konjuge çift bağlar (konjuge
dien) ve MDA ölçümüdür. Bunun yanı sıra sıkça kullanılan
parametreler arasında thiobarbiturik asit ve thiobarbiturik reaktif türevleride (TBARS) yer almaktadır (Cubrilo ve ark. 2011).
ROT lipit peroksidasyonunu başlatabilmek için biyolojik
membranlarda yer alan poliansatüre yağ asitlerinin (PUFA)
oksidasyonuna neden olur. Bu radikaller arasında en fazla reaktiviteye
sahip molekül OH• radikalidir. Bununda Fenton veya Haber Weiss reaksiyonu ile meydana geldiği tespit edilmiştir. Asıl süreç fazla reaktif
olan radikallerin, hücrelerin membranlarında yer alan PUFA’yı
etkilemesi sonucu bir hidrojen atomunu metilen gruptan (-CH2 -)
kopartmasıyla başlayabilir. Hidrojen atomu tek bir elektrona sahip olduğundan metilen gruptan bir elektron kopması neticesinde karbon üzerinde eşleşmemiş bir elektron kalır.
Yağ asitlerinde yer alan çift bağlar, kendilerine komşu karbonlar ile
147 hidrojenlerin koparılması işlemlerini de kolaylaştırmış olurlar
(Gutteridge 1995). Dolayısıyla hücrelerin membran lipitlerindeki
PUFA zincirlerinin, peroksidasyona daha çok duyarlı olduğu tespit
edilmiştir. Bir sonraki aşamada hidrojen kaybeden yağ asiti molekülleri yeniden düzenlenirler ve konjuge dien yapılarını meydana getirirler. Üretilen konjuge dien yapıları oksijenle birleştikten sonra lipit peroksil
radikallerine (LOO•) dönüşüm gerçekleşir. Neticede oluşturulan bu
peroksil radikalleri diğer yağ asitlerinden hidrojen koparabilirler ve
zincirleme peroksidayon reaksiyonlarınıda başlatabilirler (Girotti
1998). Lipit peroksidasyon reaksiyonları neticesinde lipit peroksit,
siklik peroksit ve siklik endoperoksit gibi peroksitler meydana gelirler.
Reaksiyon sonunda son ürünler olarak malondialdehit (MDA),
4-hidroksinonenal (HNE) ve hegzenal isimli aldehitlere dönüşürler
(Esterbauer ve ark. 1991). Reaksiyonların olduğu ortama bir
antioksidan eklenince membranlarda oluşan zincirleme peroksidasyon
reaksiyonları sonlanabilir. Eğer ortamda antioksidanlar yok ise peroksil
radikalleri aralarında kovalent bağ meydana getirerek membranların
yapılarını bozabilirler. Dolayısıyla membranlarda da hasar oluşturulmaya elverişli durumlar oluşur. Biyolojik membranlarda oluşturulan bu peroksidayon reaksiyonları neticesinde; membranların akışkanlıklarında bozulmalar, membranların potansiyellerinde
azalmalar, mebranların H+ ve diğer iyonlara karşı geçirgenliklerde
artışa neden olurlar. Ayrıca membranlarda rüptür gelişmesine ve
organellerin içeriklerinin sitoplazmaya aktarılmasına yol açarlar.
Dolayısıyla bu durum hücrelerde hasara ve ölüme neden olabilir (Catalá 2006).
148 ÖN LİSANS TOKSİKOLOJİ KİTABI I. CİLT
Bütün bu peroksidasyon reaksiyonları neticesinde lipit
hidroperoksitleri, aldehitler ve TBARS (ThioBarbituric Acid Reactive
Substances) meydana getirilirler. Ayrıca bunlar MDA’nın eşdeğerleri
olarak kabul edilirler ve spektrofotometrik, florometrik metotlarla dokuda veya vücut sıvılarında ölçümleri gerçekleştirilebilirler (Esterbauer ve Cheeseman 1990).
4.3. Oksidatif Stresin Hücresel Protein Yapılar Üzerine Etkisi
ROT’lar yaptığı değişiklikler neticesinde proteinlerde karbonil gruplarının oluşumuna yol açarlar. Karbonil grupların seviyesi oksidatif
stresi belirlemede önemli bir göstergedir. Dolayısıyla proteinlerde
oksidatif stresin oluşturduğu zararın en belirgin göstergesi karbonil
miktarının ölçümüdür.
Oksidatif stres neticesinde meydana gelen radikaller hücre içi
proteinlerde birtakım geri-dönüşümlü veya geri-dönüşümsüz olarak
oksidatif değişikliklere ve hasarlara neden olurlar (Rao ve Moller
2011). Protein yapıların yan zincirlerinde (prolin, arginin, lizin ve
treonin) hücre içi oksidasyonlarda karbonil grupları meydana gelirler.
Bununla beraber α-amidasyon yolağı ve glutamil yan zincirlerin
oksidasyonu neticesinde proteinlerin parçalanması vasıtasıyla da
protein karbonil yapılar meydana gelebilirler.
Ayrıca yan zincirlerdeki sistein, histidin ve lizin amino asitlerin kalıntıları, lipitlerin peroksidasyonları neticesinde üretilen MDA, HNE
149
ketoaldehit gibi karbonil türevleri ve proteinlerde lizin kalıntılarının
oksidasyon ürünleri vasıtasıyla sekonder reaksiyon geçirmeleri proteinlerde karbonil gruplarını meydana getirilebilirler (Dalle-Donne
ve ark. 2003). Ayrıca oksidatif stres hücrelerin iskeletlerini meydana
getiren proteinlerde ve enzimlerde birtakım yapısal ve fonksiyonel
modifikasyonlara neden olurlar. Bu değişiklikler içerisinde protein
karbonilasyonu geri-dönüşümü olmayan bir modifikasyon olarak kabul
edilmektedir. Ancak sisteinlerde olan değişimler ise geri-dönüşümlü
olanlar arasında kabul görmektedir (Prokai ve ark. 2007). Dolayısıyla
bu değişimler çok sayıda hastalığın altyapısının oluşmasında görev
almaktadırlar.
Protein karbonil türevleri oksidatif stres neticesinde meydana getirilen
protein oksidasyonunun en iyi göstergesi olarak kabul edilmektedir.
Aynı zamanda bu gösterge değişik hastalıklar neticesinde meydana
gelen oksidatif stres seviyesinide tespit etmek için kullanılabilir. Ölçüm
yöntemleri genellikle karbonil grupların 2,4-Dinitrofenilhidrazin
(DNPH) ve türevi dinitrofenol (DNP) üretimine dayalı olarak
yapılmaktadır. Üretilen son ürünler yaygın olarak spektrofotometrik, ELİSA ve Western Blotting gibi ölçüm yöntemleri ile tespit edilmektedir. Oksidatif stres seviylerini tespit ederken protein karbonil türevlerinin lipit peroksidasyon ürünleri ile kıyaslandığında daha avantajlı oldukları görülmektedir. Bunun nedeni daha erken oluşmaları ve daha stabil olmalarıdır. Dolayısıyla yarılanma ömrü dakikalarla sınırlı ve çok kısa olan lipit peroksidasyon ürünlerine kıyasla çok daha avantajlı durumdadırlar (Levine ve ark. 1990).
150 ÖN LİSANS TOKSİKOLOJİ KİTABI I. CİLT
4.4. Oksidatif Stres ve DNA Hasarı
ROT’lar neden oldukları değişiklikler sonucu DNA moleküllerinde de
çok sayıda hasarlara yol açmaktadırlar. Bunlar arasında; zincirlerde kırılmalar, proteinlerin oluşturduğu bağlarda çeşitli hasarlar ve temel yapılarda bozulmalar yer almaktadır. DNA’da meydana gelen zararı tespit etmek için değişik göstergeler kullanılmaktadır. Bu göstergeler içerisinde en çok başvurulanı nükleotid 8-hidroksi-2-deoxiguanozin (8-OHdG) belirtecidir.
Oksidatif stresin DNA’da oluşturduğu hasar karsinogenezis gibi çok
sayıda hastalığın alt yapılarında çok ciddi payı olduğu kabul
edilmektedir. Oldukça reaktif olan OH• radikalleri diğer moleküllerde
yaptığı gibi DNA bazlarında da çift bağlara H atomu ekleyebilir. Ayrıca
bu radikal, 2-deoksiribozun C-H bağlarından ve timindeki metil
gruplarından H atomu çıkarmak yoluyla DNA molekülü ile reaksiyon
gerçekleştirebilir (Breen ve Murphy 1995).
Aynı zamanda OH• radikalleri, DNA’da bulunan şeker kalıntılarından H atomu koparma yoluyla şeker modifikasyonlarına ve zincir kırılmalarına sebep olabilirler. Dolayısıyla hücrelerin çeşitli serbest radikallere ve oksidan maddelere maruziyeti sonucu replikasyonda ve transkripsiyonda olumsuz etkiler meydana gelebilir. Bu durum DNA tamir mekanizmalarında da baskılanmaya yol açıp DNA’da çeşitli hasarlar meydana getirebilir (Hu ve ark. 1995).
151 Oksidatif stresin DNA’da gerçekleştirdiği hasarda en ciddi patolojik aşamanın karsinogenezis olduğu kabul edilmektedir. Bunun yanı sıra oksidatif hasarın karsinogenezisin her evresinde ve malign dönüşümünde çok belirgin fonksiyonları olduğu bilinmektedir.
Oksidatif stresin DNA’da oluşturduğu hasarın en önemli belirteci
olarak artmış 8-OH-dG (8-hidroksiguanin) düzeylerine bakılmaktadır
(Hardie ve ark. 2000).
4.5. Oksidatif Stresin Diğer İndirek Belirteçleri
Bugüne kadar oksidatif stres hakkında yapılmış olan bilimsel araştırmalarda genellikle protein, lipit ve DNA yapısında meydana
gelen bozulmalar incelenmiştir. Bunların dışında dolaylı şekillerde
oksidatif stresi tespit etmek için başvurulan göstergelerde
bulunmaktadır.
4.6. Kreatin Kinaz (CK) ve Myoglobin
Oksidatif stresin kaslarda oluşturduğu hasarın indirek göstergelerinden
biridir. Bunun nedenleri arasında lipit peroksidasyonunun hücre memranında oluşturduğu hasarda yer almaktadır.
4.7. Antioksidanların Ölçümü
1. Antioksidan enzimlerin (SOD, CAT, GSH-Px) aktivitelerini belirlemek.
152 ÖN LİSANS TOKSİKOLOJİ KİTABI I. CİLT
3.1Oksidatif stresi belirlemek için sıklıkla kullanılan diğer
antioksidanların (tiol proteinler (GSH, GSSH), ürik asit, allatoin)
seviyelerini belirlemek.
4. Total antioksidan kapasiteyi (TAC) tespit etmek.