Tetrodotoksin (ġekil 3.10) düĢük molekül ağırlıklı nörotoksisitesi yüksek bir moleküldür. Bu molekülde pozitif yüklü bir guanidyum grubu ve pirimidin halkasına bağlı C-4, C-6, C-8, C-9, C-10 ve C-11 pozisyonlarında altı hidroksil grubu bulunmaktadır. Tetrodotoksin, kirpi balıklarından veya fuguların (tetraodontide ailesi) dokularından (karaciğer, bağırsaklar, gonadlar, deri, böbrek, kan) izole edilebilen bir nörotoksindir. Ayrıca sodyum voltaj kapılı proteinin iletkenliğini seçici olarak tersine çevirebilen bir inhibitördür (Kao Cy.,1966).
24 ġekil 3.10 : Tetrodotoksinin moleküler yapısı.
Sinir sisteminde voltaj kapılı sodyum kanallarının alt tipleri fizyolojik ve patafizyolojik proseslerde geniĢ yer tutmasından dolayı nörologlar tarafından bu bölgelerdeki mekanizmaların aydınlatılmasına katkı sağlamak için kullanılmıĢtır. Önceki çalıĢmalarda da TTX’in ağrı sendromunun bloke edilmesinde potansiyel bir rol oynadığı gösterilmiĢtir (Hagen ve ark., 2007). TTX aksiyon potansiyellerini interfere eden ve uyarılabilir zarlardaki implusları bloke edebilen potansiyele sahip bir moleküldür. TTX farklı sodyum kanallarına farklı afinetelerle bağlanan bir moleküldür. Kanallar arasındaki aminoasit diziliminin farklı olması kanalların TTX’e karĢı farklı direnç oluĢturmalarına neden olmaktadır. Bugün Nav kanallarının 9 farklı fonksiyona sahip formunun aminoasit dizilimleri aydınlatılmıĢtır. Bu izoformlar arasındaki transmembran ve ekstraselüler domainler arasındaki (S1-S6 helikslerinde) benzerlik %50’ den fazladır. Toksin bağlanma bölgesinde belirgin rol alan S5-S6 helikslerinde 4 domain için benzerlik oranı %90’ dan fazladır. TTX’in bağlanma afinitesi yan zincirler ve TTX arasındaki elektrostatik etkileĢimlerden kaynaklanmaktadır. Nav1.1, Nav1.2, Na1.3 ve Na1.7 TTX’e oldukça duyarlıdır. Nav1.4 ve Nav1.6’nın da TTX’e duyarlı olduğu ancak Nav1.5, Nav1.8 ve Nav1.9’un TTX’e karĢı dirençli olduğu bulunmuĢtur (Lee CH ve ark.,2008). Zira bu özelliğin kullanılması homoloji modelinde elde edilmesi yapının doğruluğu için test olacaktır. 3.4.2 NavMs ve tetrodotoksin sisteminin kurulması
Yukarıda detayı verilen (Bölüm 3.2) çalıĢmada NavMs kanalı için sistem oluĢturulmuĢ ve sistem 100 ns sürede dengeye getirilmiĢtir. ÇalıĢmamızın TTX bağlanması kısmında dengeye getirilen yapı kullanılmıĢtır. Önceki çalıĢmadan elde
25
edilen sodyum iyonlarının konumları korunurken TTX bağlanmıĢtır. NavMs sisteminde filtrede 3 iyona kadar iyon bulunabileceği yukarıda gösterilmiĢtir. TTX bağlanması çalıĢmasında farklı sayılarda iyon alınarak Autodock 4 ile docking iĢlemleri yapılmıĢtır. Tek iyonlu yapılar için diğer konumdaki iyon su ile yer değiĢtirilmiĢtir. Dockingler arasındaki farklılıklar aĢağıda sıralanmıĢtır:
- Ġyonsuz TTX bağlanması
- Tek iyon z = +3 konumunda iken TTX bağlanması - Tek iyon z = +9 konumunda iken TTX bağlanması - Tek iyon z = +7 konumunda iken TTX bağlanması - Ġki iyon z = +3 ve z = +9 da iken TTX bağlanması
Yapılan docking çalıĢmalarının incelenmesinde bağlanma enerjileri, docking pozisyonları, bu konformasyonların oluĢturduğu kümeler ve oluĢan bağlar dikkate alınmıĢtır. Yapılan beĢ farklı docking çalıĢmasının her birinde yüzer konformasyon oluĢturulmuĢtur. Tüm konformasyonlar içinde en iyi küme ve en iyi dock pozisyonları incelenip ligand-protein etkileĢimleri de dikkate alınarak en kararlı konformasyon seçilmiĢtir. Seçilen komplekslere moleküler dinamik (MD) yapılmıĢtır. Sistemler farklı süreler boyunca simüle edilmiĢtir. Ġyonsuz docking ve iyon (z:+3) iken sistem 24.5 ns, iyon (z: +9) iken 58.5 ns , iki iyon (z:+3 ve z: +9) iken 54.9 ns ve iyon (z:+7) için 51 ns MD yapılmıĢtır. Yapılan MD sonuçlarından elde edilen bağların AutoDock ile yapılan sonuçlarla uyumlu olup olmadığı karĢılaĢtırılmıĢtır. Özellikle NavMs yapısının filtre kısmındaki Glu 178 amino asiti ile ligandın etkileĢimleri incelenmiĢtir. TTX’in zamana bağlı konumu ve konformasyonu da incelenmiĢtir. Bu değerlendirmeler sonucunda iyonsuz docking ve iki iyonlu docking komplekslerinde kararlı bir yapının oluĢmadığı görülmüĢtür. Ġyon (z: +4) ve (z:+9) ile yapılan simulasyonlarda filtre içindeki her iki iyonunda zamanla (z:+7) konumuna geldiği görülmüĢtür. Bunun üzerine bir iyon (z:+7) konumundayken docking yapılmıĢ ve sonrasında MD simülasyonu yapılmıĢtır. MD sonuçlarını karĢılaĢtırmak ve daha iyi analiz etmek için aĢağıda Tablo 3.5’de komplekslerden elde edilen ikincil bağların zamanla bağ uzunluklarındaki değiĢim, standart sapmalarıyla birlikte hesaplanmıĢtır. Yapılan MD simulasyonun analizinde en kararlı yapının iyon (z:+9) ile baĢlanılan konformasyon olduğu anlaĢılmıĢtır. MD’den çıkan son dosyada TTX in kütle merkezi (z:+13), iyonun kütle merkezi (z: +7) olarak elde edilmiĢtir. NavMs-TTX kompleksinin AutoDock ve MD görüntüsü
26
ġekil 3.11’de verilmiĢtir. ġekil 3.11’den de görüldüğü üzere AutoDock ile elde edilen kompleks yapı ve MD sonucu elde edilmiĢ yapı arasında hem konformasyon değiĢikliği hem de ligand ve protein arasındaki hidrojen bağlarının sayısı açısından önemli bir fark olduğu anlaĢılmaktadır.
ġekil 3.11 : (A) NavMs ve tetrodotoksin kompleksinin Autodock ile elde edilen görüntüsü (B) Kompleksin MD sonucu ede edilen görüntüsü
Tablo 3.5 : NavMsve TTX kompleksi için MD ve AutoDock sonucu ede edilen bağlar.
Bu yapılara iliĢkin daha detaylı bir inceleme Tablo 3.5’de verilmiĢtir. Verilen tabloda AutoDock ve MD simülasyonları sonucunda tetrodotoksinin bağlanmasında ve kanalı inhibe etmesinde etkin olan aminoasitlerle, ligandın atomları arasındaki uzaklıklar verilmiĢtir. Bu aminoasitlerin belirlenmesi NavMs kanalının ligandın bağlanması için gerekli kimyasal çevrenin anlaĢılması açısından oldukça önemlidir. TTX’in bağlanmasında en önemli bölgenin kanalın filtre bölgesi oduğu açıkça görülmektedir. Ayrıca yapılan çalıĢmalar göstermiĢtir ki AutoDock ile elde edilen sonuçlar MD ile karĢılaĢtırıdığında önemli bir değiĢikliğe uğramaktadır. Bu da bize
27
docking çalıĢmalarından elde edilen sonuçların mutlaka MD ile de refere edilmesi gerekliliğini göstermektedir.