Moleküler Karakterizasyon

4.4.1. Spesifik T1/T2 primerleri ile amplifikasyon sonuçları

Denemede kullanılan 70 adet X. translucens izolatından izole edilen genomik DNA‟lar T1 ve T2 primerleri kullanılarak PCR ile amplifiye edilmiştir. PCR sonucunda oluşan amplikonlar elektroforez sisteminde yürütülerek bakteriyel izolatlara ait DNA bantları elde edilmiştir. Jel görüntüleme sisteminde belirlenen 68 bakteriyel izolata ait DNA fragmenti 139 bp‟de spesifik bantlar oluşturmuştur. Sadece 2 adet izolat aynı primerler kullanılarak 200 bp bant oluşturmuşlardır.

ġekil 7. X. translucens izolatları için T1 ve T2 primerleri kullanılarak yapılan PCR ürünlerinin %1‟lik

agaroz jelde oluşturdukları spesifik bantlar.(1: XT14, 2: XT15, 3: XT16, 4: XT17, 5: XT18, 6: XT19, 7: XT20, 8: XT21, 9: XT22, 10: XT23, 11: XT24, 12: XT25, 13: XT26, 14: XT27, 15: XT28, 16: XT29,

17: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli(XP23) Negatif izolat).

Maes ve ark. (1996), tohum örneklerinde X. translucens‟ in düşük miktarlarda bulunması durumunda bile T1 ve T2 primerleri kullanılarak 139 bp‟lik fragmentin amplifikasyonuyla güvenilir sonuçlar elde edildiğini bildirmişlerdir. Çalışmamızda da araştırıcıların önerdiği spesifik primer seti kullanılmış, biyokimyasal olarak X. translucens olarak tanılanan tüm izolatlarımızın PCR ile teşhisleri desteklenmiştir.

Baştaş ve ark. (2011), Konya ilinde 36 farklı buğday çeşidinden izole ettikleri X. translucens‟i T1 ve T2 primerleri kullanılarak 139 bp‟lik fragmentin amplifikasyonuyla güvenilir sonuçlar elde edildiğini bildirmişlerdir.

Iqbal ve ark. (2013), hastalık simptomları gösteren buğday yapraklarından izole ettikleri X. translucens‟in T1-T2 primerleriyle amplifiye edilen PCR ürünleri 200 bp bant oluşturarak potojenin X. t. pv. undulosa olduğunu bildirmişlerdir.

1 k b la d d er 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 139 bp

4.4.2. IS-PCR yöntemi kullanılarak J3 primeri ile elde edilen sonuçlar

Denemede kullanılan 70 adet X. translucens izolatından elde edilen genomik DNA‟lar J3 primeri yardımıyla ve PCR ile amplifiye edilmiştir. PCR sonucunda oluşan amplikonlara ait birçok farklı büyüklükte bant elde edilmiştir. Elde edilen bantlara göre; 68 X. translucens izolatı 150 ile 1000 bp arasında hemen hemen aynı bantlar oluştururken, 2 adet izolat sadece 150 ve 200 bp‟de bant oluşturmuşlardır. Buradan 68 izolatın Xanthomonas translucens pv. translucens, 2 izolatın ise Xanthomonas translucens pv. undulosa olabileceği kanaati oluşmuştur.

ġekil 8. X. translucens izolatlarının J3 primerleri kullanılarak yapılan PCR ürünlerin %1‟lik agaroz jelde

oluşturdukları spesifik bantlar (1: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli(XP23) Negatif izolat), 2: XT15,

3: XT16, 4: XT17, 5: XT18, 6: XT19, 7: XT20, 8: XT21, 9:XT22, 10: XT23, 11: XT24, 12: XT25, 13:XT26, 14: XT27, 15: XT28, 16: XT9, 17:XT60, 18:XT51, 19: XT65, 20: XT3).

Adhikari ve ark. (2012) J3 primeri kullanarak yaptıkları IS-PCR çalışmasında Xanthomonas translucens pv. undulosa‟yı tanımlamışlar ve Ralstonia solanacearum ve Xanthomonas oryzae pv. oryzae ile farklı genetik sınıflandırmalarını en iyi bu yöntemle ortaya çıkardıklarını bildirmişlerdir. Aynı zamanda X. t. pv. undulosa streynleri arasında bu yöntemi kullanarak patotipler ve haplotipler arasında farklılığın olmadığını göstermişlerdir. 1 k b la d d er

4.4.3. Rep-PCR yöntemi kullanılarak ERIC primerleri ile elde edilen sonuçlar

Denemede kullanılan 70 adet X. translucens izolatından elde edilen genomik DNA‟lar ERIC IR, ERIC 2, primerleri yardımıyla ve PCR ile amplifiye edilmiştir. PCR sonucunda oluşan amplikonlara ait birçok farklı büyüklükte bant elde edilmiştir. Elde edilen bantlara göre; 68 X. translucens izolatı 50 ile 1100 bp arasında hemen hemen aynı bantlar oluştururken, 2 adet izolat sadece 150 bp‟de bant oluşturmamışlardır. Buradan 68 izolatın Xanthomonas translucens pv. translucens, 2 izolatın ise Xanthomonas translucens pv. undulosa olabileceği kanaati oluşmuştur.

ġekil 9. X. translucens izolatlarının ERIC primerleri kullanılarak yapılan PCR ürünlerin %1‟lik agaroz jelde oluşturdukları spesifik bantlar (1: XT13), 2: XT15, 3: XT16, 4: XT17, 5: XT18, 6: XT19, 7: XT20,

8: XT21, 9:XT22, 10: XT9, 11: XT24, 12: XT25, 13:XT26, 14: XT27, 15: XT28, 16: XT49, 17:XT60, 18:XT51, 19: XT65, 20: XT3). 1 k b la d d er

4.4.4. Rep-PCR yöntemi kullanılarak BOX primeri ile elde edilen sonuçlar

Denemede kullanılan 70 adet X. translucens izolatından elde edilen genomik DNA‟lar BOX A1R primeri yardımıyla ve PCR ile amplifiye edilmiştir. PCR sonucunda oluşan amplikonlara ait birçok farklı büyüklükte bant elde edilmiştir. Elde edilen bantlara göre; 68 X.translucens izolatı 200 ile 900 bp arasında hemen hemen aynı bantlar oluştururken, 2 adet izolat sadece 500 ve 600 bp‟de bant oluşturmuşlardır. Buradan 68 izolatın Xanthomonas translucens pv. translucens, 2 izolatın ise Xanthomonas translucens pv. undulosa olabileceği kanaati oluşmuştur.

ġekil 10. X. translucens izolatlarının BOX primeri kullanılarak yapılan PCR ürünlerin %1‟lik agaroz

jelde oluşturdukları spesifik bantlar (1: XT13), 2: XT15, 3: XT16, 4: XT17, 5: XT18, 6: XT19, 7: XT20,

8: XT21, 9:XT22, 10: XT39, 11: XT24, 12: XT25, 13:XT26, 14: XT27, 15: XT28, 16: XT9, 17:XT60, 18:XT51, 19: XT65, 20: XT3).

Rademaker ve ark. (2005), Rademaker ve ark. (2006), Marefat ve ark. (2006), Adhikari ve ark. (2012), ERIC, BOX ve rep-PCR metodlarını kullanarak X. translucens izolatlarını tanılamışlar ve bu yöntemlerin son derece hassas ve güvenilir sonuçlar verdiğini bildirmişlerdir.

Rademaker ve ark. (2005) ERIC ve BOX primerlerini kullanarak 41 X. translucens streynini gruplandırmışlardır. Bu gruplar arasında çok büyük bir homoloji olduğu ve tüm X. translucens patovarlarının genetik benzerlik gösterdiğini Kuzey Carolina‟da yaptıkları çalışmada belirlemişlerdir.

Rademaker ve ark. (2006) ERIC ve BOX primerlerini kullanarak kuşkonmazdan izole edilen 33 patojenik streyn ile tahıllardan ve çimlerden izole edilen 61 X. translucens izolatını karşılaştırmış ve kuşkonmazdan izole edilen 33 streyni X.t.

undulosa olarak tanımlamışlardır, hasas olan Florida 302 buğday çeşidini hastalandırdığını belirtmişlerdir.

Adhikari ve ark. (2012) yine ERIC ve BOX primerlerini kullanarak North Dakota bölgesinden örnekledikleri 5 X. t. undulosa popülasyonunu analiz etmişler ve bu genotip teknikleri ile X. t. undulosa strainleri arasında moleküler polimorfizmin yüksek olduğunu bildirmişlerdir.

Patojenisite testlerine göre Xanthomonas translucens pv. translucens olarak tanılanan 68 izolatın tamamı sadece buğdayda, Xanthomonas translucens pv. undulosa olarak tanılanan 2 izolat ise hem arpa da hem de buğdayda farklı seviyelerde virülenslik göstermişlerdir.

4.5. Soyağacı Analizi Sonucu

Üzerinde çalışılan 70 X. translucens izolatı için yapılan biyokimyasal, fizyolojik, patolojik ve moleküler düzeydeki analizler sonucunda izolatların tamamına yakını (%97.14) Xanthomonas translucens pv. translucens olarak tanılanması ve yine tüm izolatların çoğrafik olarak Konya ilinden izole elde edilmiş olması sebebi ile farklılık belirlenmemiştir. Yapılan soy ağacı analizine göre Şekil 11‟de gösterilen akrabalık dereceleri belirlenmiştir.

ġekil 11. İncelenen izolatlar elde edilen soy ağacında 2 temel kol üzerinde toplanmıştır. Bu izolatlardan

XTS9 ve XTS60 nolu izolatlar %100 benzerlik göstererek kolun birini oluştururken geriye kalan izolatlar diğer kol üzerinde kendi içlerinde %100 benzerlik sergilemişlerdir.