Moleküler Genetik Analiz

Yapılan çalışmalar ile her toplumda sık görülen mutasyonlar bilinmektedir. Bu nedenle öncelikle PCR temelli testler yapılması bu mutasyonları hızla saptanmasını sağlar. Bilinen mutasyonlar arasında bulunamazsa beta globin gen sekans analizi gen üzerindeki diğer mutasyon taraması için kullanılır (6). Yeni gelişen DNA teknolojisi talasemiler ve yapısal hemoglobinopatilerin moleküler tanısında, hızlı ve yüksek doğrulukta tanı testlerinin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu yöntemler mutasyonu doğrudan tayin eden direk yöntemler ve indirek yöntemler olarak sınıflandrılır. Direk yöntemler arasında Allel Spesifik Oligonükleotid Hibridizasyon (ASO), Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS), dizi analizi, gap-PCR yöntemleri sayılabilir. Denature edici Gradient Jel Elektroforezi (DGGE) ve Denature edici Yüksek performanslı Likid Kromatografi (DHPLC) yöntemleri indirek yöntemlerdir. Ayrıca son yıllarda Multiple Ligation Probe Analysis (MLPA), Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments (QMPSF), Real-time PCR, Melting Curve Analysis (MCA) gibi yöntemler hızla kullanıma girmektedir. Moleküler tanıda yöntem/yöntemler, hastanın fenotipik bulgularına, hematolojik parametrelere ve toplumdaki sık rastlanılan mutasyonlara ve laboratuvarın özel koşullarına göre seçilir. Hemoglobinopatilerin moleküler genetik tanısında kullanılan yöntemler geleneksel olarak iki gruba ayrılmaktadır:

1. Direkt mutasyon tayini yapan yöntemler: Doğrudan özgün

mutasyonun olup olmadığını gösterirler. Nokta mutasyonları için Allel Spesifik Oligonükleotid Hibridizasyon (ASO), Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS), dizi analizi gibi yöntemler, delesyonlar için de gap-PCR yöntemi bu gruba giren örneklerdir.

2. İndirekt yöntemler: Belirli bir gen veya gen bölgesini, dizi

değişikliği olup olmadığının anlaşılması için, tarayan yöntemlerdir. Denature edici Gradient Jel Elektroforezi (DGGE) ve Denature edici Yüksek Performanslı Likid Kromatografi (DHPLC) yöntemleri bu gruba girer. Bu

yöntemlerle mutasyonun yerinin saptanmasından sonra dizi analizi ile özgün değişikliğin ortaya konulması gerekir.

2.6.1.1. Allel Spesifik Olgonükleotid Hibridizasyon (ASO)

Bu yöntem hedef dizi ile, birisi mutasyonlu diğeri de normal dizi için hazırlanmış olan iki oligonükleotid probunun hibridizasyonuna dayanır. Tanıda ilk kullanılan yöntemlerdendir. Yöntemde, belli mutasyonların sık olarak gözlendiği toplumlarda“dot blot” veya ”reverse dot blot”şeklinde uygulama ile homozigot, heterozigot ve normal genotipe sahip olanlar kolayca saptanabilir. Ticari olarak üretilen “reverse dot blot” yönteminin kullanıldığı kitler ile toplumlarda sık rastlanılan mutasyonların multipleks PCR ile çoğaltılan DNA’da kolayca tanımlanmasını mümkün hale gelmiştir. Bu yöntemde normal ve mutasyonlu problar membrana emdirilmiştir. Genomik DNA ile hibridizasyon sonucunda normal ve mutant paralel bantlar değerlendirilerek tanı konur. Ülkemizde rastlanılan alfa globin ve beta globin mutasyonlarının büyük kısmını (%90-95 oranında) kapsayan ticari kitler bulunmaktadır (Viennalab StripAssay) (Şekil 10 (34)). Bu klasik metodun prensiplerine dayanan micro-array teknolojisinin kullanıldığı tanı yöntemleri de uygulanmaktadır(5).

Şekil 10. Beta talaseminin moleküler tanısında kullanılan Strip Assay. Test ile saptanabilen mutasyonlu ve normal allelleri gösteren bantlar

2.6.1.2. Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS)

Bu yöntemde tanı konulması istenen DNA dizisi ile tam uyum gösteren primer ile yapılan PCR reaksiyonunda başarılı olur iken, 3’ ucunda dizi ile uyum göstermeyen primer ile PCR reaksiyonunun başarılı olmamasına dayanır. ARMS yöntemi için çok sayıda farklı primerler düzenlenmiştir. Bu yöntem en çok kullanılan yöntemlerden birisidir. Bilinen mutasyonların tanısında hızlı ve pratik bir test olmasına karşın her primer için ayrı

standardizasyon gerektirir ve test koşulları iyi standardize edilemediği zaman yalancı pozitif ve yalancı negatif sonuçlar gözlenebilir (5).

2.6.1.3. Gap-PCR

Delesyon tipinde mutasyonları tayin etmede ideal yöntemlerdendir. Tam olarak sınırları bilinen delesyon şeklindeki mutasyonların saptanmasında kullanılır. Delesyonun olduğu DNA bölgesinde 5’ ve 3’ bölgelerinde bir kısım diziye uyan primerlerle bölge çoğaltılır. Çoğalan delesyonlu DNA bölgesindeki diziler normal ile kıyaslandığında daha küçüktür. Beta talasemiye neden olabilen nadir görülen β geni delesyonları, alfa talasemiye neden olan α genlerindeki delesyonlar, δ- β talasemiler, Hb Lepore tanısında kullanımı kolay ve ucuz bir yöntemdir. Allel drop-out oluşmasına yatkın bir yöntemdir (5).

2.6.1.4. DNA Dizi Analizi

Moleküler tanı koymada en güvenilir yöntemlerdendir. Daha çok nokta mutasyonlarının sık görüldüğü ve mutasyon dağılımı geniş olan toplumlarda β globin geni analizi için bazı laboratuvarlarda ilk yöntem olarak kullanılmaktadır. Ayrıca birçok laboratuvarda, diğer ucuz ve pratik tanı yöntemleri ile gösterilemeyen mutasyonları saptamak için uygulanmaktadır. Örneklerin hazırlanması ve sonuçların okunması özel beceri gerektirir. Dizi analizinde heterozigotların saptanmasında dikkatli bir gözle analiz yapılmalıdır. Delesyonların, özellikle büyük delesyonların bulunduğu, α talasemi gibi, hemoglobin bozuklukları için uygun değildir (5).

2.6.1.5. Denature Edici Yüksek Performanslı Likid Kromatografi (DHPLC) Yöntemleri ve Gradient Jel Elektroforezi (DGGE)

PCR ürününde bilinmeyen mutasyonların olduğu bölgeleri saptamada kullanılan yöntemlerdir. Her iki yöntem de jel üzerinde mutant ve normal allelin farklı hareket etmesi prensibine dayanır. Elde edilen sonuçlara göre mutasyonun saptanmasında başlıca dizi analizi olmak üzere bir diğer

yönteme gereksinim vardır. DHPLC metodu hem bilinen hem de bilinmeyen β geni mutasyonlarını saptamada güvenilir ve yüksek duyarlılıkta, nispeten ucuz bir tekniktir (5).

2.6.1.7. Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments (QMPSF)

Kısa ekzonik dizilerin multipleks PCR ile çoğaltılmasına dayanan yarı kantitatif bir yöntemdir. Özellikle gen içindeki delesyon ve duplikasyonların saptanmasını sağlar (5).

2.6.1.8. Real-Time PCR

Günümüzde PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlayan cihazların gelişimi ve flöresan ışıma tekniklerinin kullanılması ile gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerde ölçmek ve devam eden PCR reaksiyonuna gerçek zamanlı (real time olarak) müdahale etmek mümkün olmuştur. Bu teknoloji“flöresan kantitatif RT-PCR”, “kantitatif kinetik PCR”gibi çeşitli adlarla da isimlendirilmektedir. Hedef DNA dizisini hem

çoğaltan hem de kantifiye eden bir laboratuvar yöntemidir.

Hemoglobinopatilerin tanısında pratik ve güvenli bir teknik olarak rutin uygulamaya hızla girmektedir. Normal alleli ve mutasyonlu alleli gösterecek problar farklı erime dereceleri gösterecek şekilde düzenlenir. Tek nükleotid mutasyonlarında elde edilen normal ve mutant alleli gösteren eğriler arasında genellikle 5-10 derecelik bir farklılık olur. Böylece mutant ve normal alleller kolaylıkla ayırt edilebilir.

2.6.1.9. Multiple Ligation Probe Analysis (MLPA)

Delesyon tipinde mutasyonları saptamada Southern blot, FISH ve gap- PCR gibi zaman alıcı ve zor tekniklerin yerini almaktadır. Son yıllarda hızla rutin kullanıma girmiş olan ucuz ve pratik bir yöntemdir. Hedef bölgedeki kopya sayısı değişikliklerini saptama esasına dayanır. Hedef bölgeye çok sayıda probun hibridize edildikten sonra, bu hibridize edilen probların

universal-tag PCR probları kullanılarak kantitatfif PCR ile çoğaltılmasına ve elde edilen fragmentlerin özel bilgisayar programları kullanılarak analiz edilmesine dayanır. α ve β gen bölgelerini kapsayan MLPA ticari kitleri üretilmiştir (5).

2.6.1.10. Yeni Nesil Dizi Analizi

Son yıllarda çok sayıda geni bir arada, tüm ekzonları veya tüm genomu dizileyebilen cihazlar geliştirilmiştir. Yakın gelecekte tüm globin genlerini, modifiye edici genleri bir arada dizileyerek daha ayrıntılı genomik bilgiye ulaşmak, fenotip için daha doğru öngörüde bulunmak mümkün hale gelecektir. Sonuç olarak, hemoglobinopatilerin moleküler genetik tanısıda kullanılan birçok yöntem geliştirilmiş ve geliştirilmektedir. Bazen tanıda yukarıda sayılan yöntemlerden birden fazlasının kullanılması gerekebilir. Tanıda kullanılacak yöntemin/yöntemlerin saptanmasında analiz yapılacak hasta veya taşıyıcılarda fenotipik bulguların ve hematolojik parametreler ile hemoglobin elektroforezi sonuçlarının iyi değerledirilmesinin yanı sıra toplumda sık rastlanılan mutasyonların ve her laboratuvarın özel koşullarının da dikkate alınması gerekir (5).