3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.5 Moleküler ÇalıĢma AĢamaları
Arazi çalıĢmaları sırasında toplanan bitkiler Silika jelde kurutulup ve -80°C de muhafaza edilirken; süreç içerisinde sırası ile aĢağıdaki çalıĢmalar gerçekleĢtirilmiĢtir.
DNA Ġzolasyonu ve SaflaĢtırılması
DNA konsantrasyonunun spektrofotometrik ölçümü
ISSR belirteçlerinin belirlenmesi için PZR optimizasyonları
Agaroz-Jel Elektroforezi
Veri Analizi
3.5.1 DNA izolasyonu ve saflaĢtırılması
Türlere ait yaprak örneklerinden genomik DNA özütü elde etmek için yapılan deneme çalıĢmalarında K. wagenitzii türü için Thermo scientific GeneJeT Plant Genomic Purufication Kit izolasyon kitinin en iyi sonuç verdiği görülürken, M. adilii ve V.
gypsicola türleri için Macherey-NagelNucleoSpin® Plant II DNA izolasyon kitinin en uygun sonuçları verdiği gözlenmiĢtir.
K. wagenitzii taksonunda Thermo izolasyon kiti ile çalıĢılmıĢ ve protokol aĢamaları aĢağıdaki Ģekilde uygulanmıĢtır.
1. Kuru yaprak örneklerinden 40 mg alınarak, havanda steril kum ile birlikte ezilip toz haline getirilmiĢtir.
2. 1.5 ml‟lik ependorf içine 350 µL Lysis buffer A konup ve üzerine toz halindeki örnek aktarılarak 10-20 saniye vortekslenmiĢtir.
3. Tüpün üzerine 50 µL Lysis buffer B ve 20 µL RNase A eklenmiĢtir.
4. Hazırlanan tüp 60 dk 65°C de inkübe edilmiĢtir.
40
5. Ġnkübasyondan alınan tüpün üzerine 130 µL Precipitation Solüsyonu eklenip ve 2-3 kez ters çevrilerek karıĢımı sağlandıktan sonra 5 dk buzda bekletilmiĢtir.
6. Buzdan alınan tüp 6 dk 13.000 rpm de santrifüj edilmiĢtir.
7. Üstteki sıvı (genellikle 450-550 µL) alınarak ve temiz 1.5 mL lik ependorfa aktarılmıĢ ve üzerine 400 µL Plant gDNA Bunding solüsyonu eklenerek ardından 400 µL %96 lık etanol eklenerek iyice karıĢması sağlanmıĢtır.
8. Hazırlanan karıĢımın yarısı (600-700 µL) spin tüpüne ( filtreli tüpe) aktarılıp ve 1 dk 8.000 rpm de santrifüj edilmiĢtir. Çıkan sıvı dökülürek ve tüpe karıĢımda kalan sıvı eklenerek tekrar 8.000 rpm de santrifüj edilmiĢtir.
9. Santrifüjden alınan tüpe 500 µL Wash Buffer I (1 mL, 2 mL veya 2.4 mL %96 lık etanol eklenmiĢ) eklenerek ve 10.000 rpm de 1 dk santrifüj edilmiĢtir.
10. Üzerine 500 µL Wash Buffer 2 (1 mL, 2 mL veya 2.4 mL %96 lık etanol eklenmiĢ) eklenerek ve 4 dk 13.000 rpm de santrifüj edilmiĢtir.
11. Sıvıyı döktükten sonra filtreli tüp yeni bir 1.5 mL lik ependorfa yerleĢtirilmiĢtir.
12. Filtreli tüpün ortasına 100 µL Elution buffer eklenip oda sıcaklığında 5 dk inkübe edildikten sonra 13.000 rpm de 1 dakika santrifüj edilmiĢtir. Daha sonra bu iĢlem ikinci kez tekrarlandıktan sonra DNA hazır hale getirilmiĢtir.
13. Hazır olan saf DNA ürünü -20°C de muhafaza edilmiĢtir.
Muscari adilii ve Verbascum gypsicola türlerinde Macherey-NagelNucleoSpin® Plant II DNA izolasyon kiti kullanılmıĢ ve bu protokol aĢağıdaki Ģekilde uygulanmıĢtır.
1. Kuru yaprak örneklerinden 30 mg alınarak havanda steril kum ile birlikte ezilip toz haline getirilmiĢtir.
2. 1,5 ml‟lik ependorflara toz halindeki örnekler aktarılıp daha sonra 400 µL PL1 tamponu ve 10 µL RNase eklenerek 15-20 saniye vortekslenmiĢtir.
3. KarıĢım 60 dk 65°C de inkübe edilmiĢtir.
4. Ġnkübasyon iĢlemi tamamlandıktan sonra karıĢım 2 ml‟lik tüp içine yerleĢtirilmiĢ mor halkalı NucleoSpin I filtrelerine aktarılarak 2 dakika 13.000 rpm de santrifüj edilmiĢtir.
5. Santrfüj sonunda 2 ml‟lik tüpte biriken karıĢım yeni bir 1,5 ml‟lik ependorfa aktarılmıĢ ve mor halkalı tüpler atılmıĢtır.
41
6. Ependorf içindeki karıĢım üzerine 450 µL PC tamponu eklenmiĢ ve karĢım 5-10 saniye vortekslenmiĢtir.
7. Vortekslemeden sonra karıĢım, 2 ml‟lik tüp içine yerleĢtirilmiĢ yeĢil halkalı NucleoSpin II filtrelerine aktarılarak 1 dakika 13.000 rpm de santrifüj edilmiĢtir.
8. Santrifüj sonunda 2 ml‟lik tüp içindeki sıvı atılmıĢ ve yeĢil halkalı NucleoSpin II filtreler iki aĢamalı yıkama iĢlemlerine tabi tutulmuĢtur.
9. Birinci aĢamada yeĢil halkalı NucleoSpin II filtre içine 400 µL PW1 tamponu eklenerek 13.000 rpm de 1 dakika santrifüj edilmiĢtir. Santrifüj sonunda tüp içerisinde biriken sıvı atılmıĢtır.
10. Ġkinci aĢamada yeĢil halkalı NucleoSpin II filtre içine önce 700 µL PW2 tamponu eklenip 13.000 rpm de 1 dakika santrifüj edilmiĢ ve santrifüj sonunda tüpte biriken sıvı atılmıĢtır. Daha sonra yeĢil halkalı NucleoSpin II filtre içine 200 µL PW2 tamponu eklenip 13.000 rpm de 2 dakika santrifüj edilmiĢtir.
11. Yıkama iĢlemlerinin tamamlanmasıyla birlikte 2 ml‟lik tüp içinde biriken sıvı ile birlikte atılırken yeĢil halkalı NucleoSpin II filtreler yeni bir 1,5 ml‟lik ependorf içine bırakılmıĢtır.
12. Filtreli tüpün ortasına bir süre 65°C‟de bekletilen Elution buffer‟dan 50 µL eklenip oda sıcaklığında 5 dk inkübe edildikten sonra 1 dakika 13.000 rpm de santrifüj edilmiĢtir. Daha sonra bu iĢlem ikinci kez tekrarlandıktan sonra DNA hazır hale getirilmiĢtir.
13. HazırlanmıĢ olan saf DNA ürünü -20°C de muhafaza edilmiĢtir.
3.5.2 DNA konsantrasyonunun spektrofotometrik ölçümü
Her üç taksona ait, izolasyonlar sonucu elde edilen DNA örneklerinin miktar ve saflık tayinleri Nanodrop spektrofotometre cihazında A260-280 nm ve A260-230 nm dalga boylarında okunarak tespit edilmiĢtir. Ölçümler yapıldıktan sonra K. wagenitzii ve V.
gypsicola türlerine ait DNA örnekleri PZR uygulamalarında kullanılmak üzere 10 ng/µl‟ye seyreltilirken, M. adilii türüne ait DNA örnekleri 8 ng/µl‟ye seyreltilmiĢtir.
42
3.5.3 ISSR belirteçlerinin belirlenmesi için PZR optimizasyonları
Türlere ait DNA özütleri ve spektrofotometrik ölçümler tamamlandıktan sonra her üç tür için, ayrı ayrı türlerin yayılıĢ gösterdikleri farklı lokalitelerinden toplanan örneklerden üçer tane genomik DNA özüt örneği alınıp PZR protokolleri uygulanarak optimizasyonları gerçekleĢtirilmiĢtir. Üç tür içinde ayrı ayrı 54 adet farklı ISSR belirteci kullanılmıĢtır. Optimizasyon denemeleri sonucunda elde edilen PZR ürünleri Agaroz Jel elektroforezinde yürütüldükten sonra görüntüleme cihazı yardımı ile her üç tür için çeĢitlilik veren bantlar belirlenmiĢtir.
ÇalıĢmada kullanılan ISSR PZR TD (Touchdown) protokolü Çizelge 3.2 ve PZR çözelti karıĢımları içerisinde kullanılan bileĢenler Çizelge 3.3 de belirtilmiĢtir.
Çizelge 3.2 ISSR-PZR TD (TOUCHDOWN) Protokolü
PZR iĢlem basamağı Sıcaklık Süre Döngü sayısı
Ön Denatürasyon 95°C 5 dk 1 döngü
Denatürasyon 95°C 30 sn
Bağlanma 57-47°C 45 sn 15 döngü
Uzama 72°C 1 dk 30 sn
Denatürasyon 95°C 30 sn
Bağlanma 45°C 30 sn 23 döngü
Uzama 72°C 1 dk 30 sn
Son uzama 72°C 7 dk 1 döngü
Çizelge 3.3 PZR mix içerisinde aĢağıda belrtilen hacimlerde ve konsantrasyonlarda PZR bileĢenleri kullanılmıĢtır.
BileĢenler Final Konsantrasyon 1 tüp
PZR suyu - 14,35 µl
10 X Tampon (with Mg++) X 2 µl
5 Mm dNTP mix 200µ 1,2 µl
10 µM primer 0,4µ 0,8 µl
5U/ Taq 1U 0,15 µl
DNA (10ng/µl) 10 ng 1,5 µl
Toplam 20 µl
43 3.5.4 Agaroz-Jel Elektroforezi
PZR iĢlemleri tamamlandıktan sonra çoğaltılan DNA örneklerinin bulunduğu tüplere 1,5 µl yükleme tamponu eklenip karıĢmaları sağlanmıĢtır. DNA fragmentlerinin yürütülebilmeleri amacıyla %2‟lik Agaroz-Jelde 0,5X‟lik TBE çözeltisi hazırlanmıĢ ve bu hazırlanan çözelti içerisine DNA fragmentlerinin yerlerini belirleyebilmek amacıyla UV ıĢığı altında floresan etki gösteren etidyum bromür (EB) boyasından 7 µl eklenmiĢtir. Yükleme tamponu ile karıĢımı sağlanan PZR ürünlerinden 5 μl‟lik hacimlerde kuyucuklara aktarılmıĢtır. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacıyla ilk ve son kuyucuklarla birlikte popülasyonlar arasındaki birer kuyucuklara 1,5 μl hacimde DNA moleküler ağırlık belirteci yüklenmiĢtir K. wagenitzii ve V. gypsicola türlerinde kullanılan moleküler ağırlık belirteci 100-3000 bp arası olan ABM DNA moleküler ağırlık belirteci iken M. adilii türünde 50-1500 bp arası olan Thermo moleküler ağırlık belirteci kullanılmıĢtır. Yatay elektroforez tank içerisindeki çözeltide, agaroz jel 90 voltta 3,5 saat süreyle yürütülmüĢtür. Yürütme iĢlemlerinden sonra oluĢan bant profilleri BioRad Molecular Imager DocXR+ analiz cihazı ile görüntülenerek kaydedilmiĢtir.
3.5.5 Veri analizi
ISSR metodu ile elde edilen bant görüntüleri BioRad Molecular ImagerDocXR+
cihazında skorlanabilmeye uygun formatta kaydedildikten sonra, veriler ikili matrikste var (1) ve yok (0) olarak skorlanmıĢtır. Veri dosyaları analiz programlarına uygun formatlarda hazırlanmıĢtır. Gözlemlenen allel sayısı (Na), etkili allel sayısı (Ne), Polimorfik lokus sayısı (PLS), Polimorfik lokus yüzdesi (PLY), Nei (1973) gen çeĢitliliği (H), Shannon bilgi indeksi (I), gibi parametreler POPGENE ver 1.32 (Yeh vd.1997) ve GenAlEx ver 6.5 (Peakall & Smouse 2012) programları aracılığıyla hesaplanarak taksonların popülasyon ve tür düzeylerindeki genetik çeĢitlilik verileri hesaplanmıĢtır. Nei‟nin (1973, 1987) gen çeĢitliliği hesaplanmasında H= Σ(1- pi 2 – qi 2 )/n) formülü kullanılırken, Shannon bilgi indeksi (I) hesaplanmasında I = - Σpilog2pi formülünü içeren (Lewontin 1972) POPGENE ver 1.32 (Yeh vd.1997) ve GenAlEx ver
44
6.5 (Peakall & Smouse 2012) programları kullanılmıĢtır. Popülasyonlar içerisindeki genetik çeĢitlilik (HS), popülasyonlar arasındaki genetik çeĢitlilik (GST) ve toplam genetik çeĢitlilik (HT) değerleri, Nei gen çeĢitlilik (Nei 1987) metodu aracılığı ile oluĢan istatistiksel verilere göre hesaplanmıĢtır. Popülasyonlar arasındaki gen akıĢ (NM) oranlarının belirlenmesinde, popülasyonlar arası faklılaĢma (GST) değerlerine dayanan NM=0,5(1-GST)/GST formülü kullanılarak hesaplanmıĢtır (McDermott ve McDonald 1993). Bireyler arasındaki genetik iliĢki, Jaccard benzerlik katsayısı (Jaccard 1908) aracılığıyla genotipler arasındaki ikili genetik mesafe miktarlarını esas alan UPGMA (Aritmetik Ortalama ile Ağırlıksız Çift Grup Yöntemi) kullanılarak SYN-TAX 2000 programıyla oluĢturulmuĢtur (Podani 2001). UPGMA dendrogramı ile oluĢan kümeleme analizlerinin korelasyonu GenAlEx programı aracılığıyla oluĢturulan PCoA (Temel Koordinat Analizi) kümeleme analizleriyle incelenmiĢtir. AMOVA varyans analizleri kullanılarak popülasyonlar arası ve içerisindeki genetik farklılaĢma incelenmiĢtir. FST
(Fiksasyon göstergesi = F-statistics) değerinin analogu olan (ɸPT) değeri GenAlEx programı ile hesaplanmıĢtır. Populasyonlar arası genetik mesafe ile coğrafik mesafe arasındaki korelasyonun belirlenmesinde GenAlEx programında MANTEL Test (Mantel 1967) programı kullanılmıĢtır.
45