As bases de dados biológicos são fontes de informações muito utilizadas para as pesquisas científicas, desempenhando papel fundamental na propagação do conhecimento a novas sequências e a análises sistêmicas. Entretanto, por muitas vezes, bases de dados de ortólogos sofrem com a falta de informação causada pela metodologia de criação ou pela falta de atualização, que não consegue acompanhar a gigantesca geração de novos dados.
Observamos que a base de dados KEGG Orthology, apesar da quantidade de dados já presentes, ainda tem muitas informações a serem acrescentadas. Isso foi evidenciado ao identificarmos uma grande proporção de anotações especuladas que foram solucionadas ao usarmos proteínas fora do KO para designar essas ESTs. Ou essas proteínas às quais as ESTs são designadas pertencem a agrupamentos do KO que não recrutaram proteínas de C. elegans, ou são proteínas relacionadas às que anotam a EST (o melhor alinhamento com a proteína do organismo que anotou também estaria na porção extra-KO) - neste último caso, a anotação já se caracteriza como um passo inicial para o estudo funcional completo de um pos´sivel novo grupo KO. Porém, o processo de agrupamento demanda uma intensa análise manual. Hoje, atendendo a necessidade de automatização do processo, a base KEGG já desenvolve um método, chamado KOALA, para propagar a anotação e aumentar os grupos de ortólogos já existentes (Kanehisa, Goto et al., 2010).
O nosso procedimento de enriquecimento baseado no recrutamento de proteínas do UniProt, é um importante esforço para essa nova tendência de automações da propagação do conhecimento. Uma base de dados enriquecida confere ao usuário uma maior amplitude de informações, seja em níveis taxonômicos ou protéico, e para algumas áreas da ciência essa quantidade de dados torna-se essencial.
Um papel importante desempenhado pelo procedimento do UECOG é a criação de uma base chamada COG Editado. O COG não é atualizado desde 2003, ao longo desse período várias entradas deixaram de existir e vários GIs associados a proteínas COG foram substituídos por outros. A base COG Editado atualiza essas informações de GIs que foram trocados e remove entradas descontinuadas, além da remoção de fragmentos de proteínas presentes na base original. O procedimento de enriquecimento, por sua vez, mostra-se eficiente ao objetivo proposto, que é de aumentar a quantidade e qualidade da informação disponível nessa base de dados.
da quantidade de informações no KO. O aumento da quantidade de organismos representados é também de suma importância já que permite uma anotação de uma sequência por uma proteína de um organismo mais próximo. Essa disparidade filogenética entre KO e UEKO foi evidenciada ao compararmos os organismos usados pelas bases de dados para anotar ESTs e metagenomas. Nessa comparação, muitas vezes uma sequência era anotada por organismos distantes um do outro, compartilhando um ancestral comum no nível de super-reino. Ou seja, ao contrário até do que esperávamos, a melhoria da anotação não foi evidenciada somente pela adição de organismos mais próximos filogeneticamente aos já existentes na base. Outra melhoria qualitativa está mostrada na melhoria significativa dos escores das associações feitas pelo BLAST. Uma pequena diferença quantitativa também ocorreu. Registramos mais de 100 grupos KO com alinhamentos com sequencias de metagenômica, o que se refletiu em preenchimentos de algumas lacunas no mapa metabólico.
As bases UECOG e UEKO, apesar de utilizarem o mesmo procedimento para o enriquecimento, apresentam sequências e até mesmo grupos exclusivos. Cerca de 17,7% das entradas presentes no UECOG não estão presentes no UEKO. Dentre os 4.588 grupos presentes na versão UECOG 2.0, 1.160 não tem nenhuma de suas proteínas representadas no UEKO. Isso acontece porque 1.004 desses grupos que não estão incluídos no UEKO são formados por proteínas com função desconhecida, proteínas não caracterizadas ou com função geral predita. Entretanto existem informações relevantes que não estão presentes no UEKO, por exemplo, o grupo COG3209 (Rhs family protein), que está presente no UECOG com 473 entradas, e nenhuma delas está na base KO. Genes RhsB, que compõe o grupo no UECOG são encontrados na base KEGG Genes, mas não organizados em grupos de ortólogos.
Essa falta de informação na base de dados recrutadora passa a ser um fator limitante para o recrutamento final. Como exemplo temos um grupo K01123 (sphingomyelin phosphodiesterase), que não possui nenhuma proteína. Entretanto, o número EC associado a esse KO (EC: 3.1.4.41), é atribuído à 214 proteínas do UniProtKB, que teriam potencial para enriquecer a base caso esse grupo tivesse alguma entrada recrutadora. Caso semelhante acontece com os números EC: 2.1.1.57 (109 proteínas no UniProt) e EC: 2.7.7.68 (89 entradas UniProt) que não possuem um agrupamento KO para alocar suas proteínas.
Além da falta de proteínas recrutadoras, sofremos com a qualidade das mesmas quando erroneamente presentes em um grupo. Como exemplos temos as entradas do UniProtKB A1W7V7 e A1W9A1. Essas proteínas estão presentes na base KO originalmente no agrupamento K00134 (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase), mas na realidade pertencem
ao K00150 (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase NAD(P)). O procedimento UEKO é capaz de associar essas duas entradas ao K00150, porém não as retira do K00134. Um processo de edição e validação da base de dados original melhoraria a qualidade e quantidade do enriquecimento.
A análise metagenômica utilizando 13 amostras públicas permitiu uma valorização da qualidade da anotação proporcionada pela base UEKO. Além disso identificamos um genoma mínimo, composto por funções que todos os indivíduos tem, supostamente essencial para a sobrevivência da micriobiota. Nesse genoma mínimo identificamos funções exclusivas de infantes, e a evidente diferença da composição filogenética e funcional desses para com os indivíduos com microbiota já estável. Essa diferença orientada pela presença de bactérias do gênero Bifidobacterium já é conhecida e serve como suporte para a eficácia da nossa análise (Sela, Chapman et al., 2008).
Uma outra análise metagenômica realizada identificou perfis filogenéticos interligados com perfis funcionais na microbiota. Esses perfis são chamados de enterotipos, e 2 deles são proeminentes e presentes em diferentes conjuntos de amostras estudadas. Esses perfis independem da etnia e hábitos alimentares dos indivíduos, uma vez que os enterotipos misturam amostras de diferentes países: Japoneses, Francês e Espanhol no grupo predominado por Bacteroides; e Espanhóis, Dinamarqueses, Francês e Italiano no grupo guiado por Prevotella. Além disso os enterotipos foram mantidos quando comparamos indivíduos do mesmo país.
É relevante ressaltar a similaridade entre os perfis filogenéticos e funcionais, e essa consistência dos enterotipos sugere que eles são resultado de uma composição definida e bem equilibrada da comunidade microbiana. Esses grupos podem ser usados para a identificação de um indivíduo, uma vez que estudos mostram um significante estabilidade da microbiota e que pode até ser restaurada após uma perturbação (Tannock, Munro et al., 2000; Vanhoutte, Huys et al., 2004; Costello, Lauber et al., 2009).
Uma análise mais detalhada permite ligar as composições filogenética e funcional. Os principais gêneros do primeiro enterotipo, Bacteroides e com co-ocorrência de Parabacteroides, parecem ter sua fonte de energia primariamente através da fermentação de carboidratos e proteínas, uma vez que esses gêneros tem um imenso potencial sacarolítico (Martens, Koropatkin et al., 2009). Além disso, genes que codificam enzimas envolvidas na degradação desses substratos (galactosidases, hexosaminidases, proteases), assim como glicólise e via de pentose-fosfato estão super-representadas, como mostrado na Tabela 17. A prevalência de Prevotella e Desulfovibrio no segundo enterotipo pode estar associada a
degradação de mucina, uma glicoproteína presente na mucosa intestinal. Esses dois gêneros agem em sinergia, uma vez que Prevotella é conhecido como um degradador de mucina e Desulfovibrio poderia melhorar o desempenho da degradação pela remoção do grupo sulfato (Wright, Rosendale et al., 2000). O terceiro grupo é rico nos gêneros Ruminococcus e Akkermansia, também conhecidos pela degradação de mucina (Derrien, Vaughan et al., 2004), e super-representado por transportadores de membrana, principalmente açúcares, sugerindo uma degradação da mucina e absorção dos açúcares simples resultantes.
O enriquecimento de determinados gêneros sugere que os enterotipos utilizam diferentes caminhos para a obtenção de energia fermentando substratos disponíveis no intestino, mostrando uma especialização e adaptação a diferentes nichos ecológicos.
A microbiota também tem um papel fundamental na conversão de substratos complexos em produtos que possam ser absorvidos por humanos, inclusive na produção de vitaminas. Observamos uma evidente complementaridade entre a microbiota e o metabolismo humano, dando mais suporte à esse visível mutualismo existente.
A aplicação das bases de dados enriquecidas em estudos funcionais reforça a necessidade de sua atualização de forma automatizada, tanto para estudos de genômica funcional, pois pesquisadores com interesses pontuais obtém uma amostragem de todas as proteínas completas com possível relação filogenética, o que foi exemplificado pela ocorrência de entradas de clados distantes, como também para análises sistêmicas, por sua vez exemplificado pela aplicação na caracterização metabólica. Os produtos UECOG e UEKO serão a partir daqui distribuídos pelo laboratório de Biodados da UFMG, em uma periodicidade mensal. Sua utilização, entretanto, em outros estudos do grupo de pesquisa já é frequente.