MiSeq (Illumina, San Diego, CA, ABD) Cihaza Yükleme

ölçme cihazı ile ölçüldü.

2. Her bir PCR ürününden 100 ng DNA girecek şekilde 0,2mL’lik PCR tüpünde birleştirildi.

53 3. Son konsantrasyonu 4 nM olacak şekilde nükleaz içermeyen distile su ile dilüe edildi.

4. 4 nM konsantrasyonu olan örnekten 5 μL ependorf tüpüne aktarıldı ve üzerine 5 μL 0.2 nM NAOH eklendi. 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi.

5. 990 μl Hybridization Buffer eklendi. 6. %1 PhiX control eklendi.

7. 96˚C 2 dakika inkübe edildi.

8. 5 dakika buzlu su içinde inkübe edildi. 9. MiSeq (Illumina, ABD) cihazına yerleştirildi. 3.4.5. Veri Analizi

Sekans verileri, NCBI GenBank’tan ulaşılan referans sekanslar ile (NS5B için; GenBank Genotip 1a AF009606.1, Genotip 1b S62220.1, Genotip 2 AF177036.1, Genotip 3 KJ470615.1, Genotip 4 Y11604.1, Genotip 5 Y13184.1, Genotip 6 NC_009827, Genotip 7 NC_030791.1) CLC Genomics Workbench versiyon 8.1 kullanılarak, %1 eşik değer ile analiz edildi. Genotip belirleme NCBI gen bankasındaki (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

projects/genotyping /formpage.cgi) verilerle karşılaştırılarak ve NCBI HCV

genotyping tool kullanılarak yapıldı.

(Filogenetik ağaçlarda kullanılan referans dizilerin GenBank ulaşım numaraları: 5’NCR için 1b: KX214760.1, KP861316.1, AJ006332.1, KY039950.1, LN681362.1, 1a: KX214758.1, KY039953.1, LN681367.1, AJ006333.1, EF205216.1, 2: AB853938.1, GQ418264.1, GQ418261.1, KM409563.1, EF540348.1, 3: GQ418284.1, EF540350.1, FN668896.1, AY306321.1, 4: JN808433.1, GQ418285.1, KM409552.1, AB548326.1, 5: DQ164771.1, DQ164776.1, HQ396503.1, KT748878.1, 6: EU127993.1, AY862542.1, EF115753.1, JQ318185.1, KJ678423.1, 7: NC_030791.1. NS5B için 1b: AF388501.1, DQ417452.1, JN116561.1, FJ709553.1, FJ709526.1, GU441452.1, GU441399.1, GU441397.1, 1a: DQ313466.1,

54 JN116560.1, JN116559.1, GU441391.1, FJ159816.1, 2: FJ159840.1, FJ159833.1, KU870953.1, JQ318481.1, JQ318299.1, GQ418369.1, GU441456.1, GU441446.1, JQ318481.1, JQ318299.1, 3: EF116090, KU870966.1, EF116092.1, 4: GQ418389.1, MG453456.1, JN116562.1, KF463187.1, JN203188.1, KY627930.1 5: JN116566.1, MG453577.1, MG453514.1, KU870974.1, DQ164544.1 6: MG453365.1, KX940885.1, KT921388.1, MG454550.1 7: NC_030791.1)

Dizilerin hizalaması DNAStar MegAlign 5.06 (version 5.06; DNASTAR, Madison, WI, ABD) programında, Clustal W yöntemiyle yapıldı. Filogenetik ağaçlar yine DNAStar MegAlign 5.06 (version 5.06; DNASTAR, Madison, WI, ABD) programında ‘Neighbor-Joining method’ ile çizildi, FigTree v1.4.3 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) programı ile düzenlemeleri yapıldı. Dizilerin evrimsel uzaklık ve benzerlik hesapları DNAStar MegAlign 5.06 programında Kimura yöntemi kullanılarak yapıldı. Ayrıca, 5’NCR bölgesinin Stuyver (123) tarafından tanımlanan HCV genotipleri için özgül bölgeleri ile karşılaştırması yapıldı.

55 4. BULGULAR

Çalışmamıza dahil edilen 60 plazma örneği, 60 HCV pozitif hastaya (31 kadın 29 erkek, yaş aralığı: 29 – 83, ortanca yaş: 64) aitti.

Yeni nesil dizileme ve Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu ile elde edilen dizilerin analiziyle belirlenen genotip sonuçları tablo 4’te gösterilmiştir.

NS5B bölgesinin hem YND ve Sanger ile, hem de 5’NCR bölgesinin YND ve Sanger ile (yöntemlerin tümünde) genotip sonuçları benzer bulunan örnekler: Altmış örneğin 55’inde (%91,67) genotip sonuçları aynı bulunmuştur. Bu örneklerden genotip 1 olarak bulunan 41’inden 39’u 1b, ikisi 1a olarak belirlenmiştir. Ancak, üçünde 5’NCR bölgesinin YND ve Sanger analizi ile alttipi belirlenemiş, NS5B bölgesinin analizinde üçü de her iki yöntemle 1b olarak tanımlanmıştır. Yedi örnek genotip 4, dört örnek genotip 3, iki örnek genotip 5, bir örnek genotip 2 olarak belirlenmiştir.

NS5B bölgesi ile 5’NCR bölgesinin analizinde farklı genotip sonuçları bulunan örnekler: İki örnek blastta NS5B dizilerine göre 1b, 5’NCR dizilerine göre genotip 6 olarak tanımlanmıştır, ancak 5’NCR dizileri Stuyver’in genotip belirleyici altı bölgesi (R1-R6) ile değerlendirildiğinde genotip 1’e uydukları görülmüştür. Bir örnek NS5B dizisine göre 1b, 5’NCR dizisine göre 1a olarak tanımlanmıştır. Genotip 1 alttiplerinin belirlenmesinde daha güvenilir olduğu bilindiği için NS5B sonuçları kabul edilmiştir.

YND ile Sanger analizlerinin uyumu: Altmış örneğin 59’unda hem NS5B, hem de 5’NCR dizileri YND ve Sanger analizleriyle aynı sonuçları vermiştir (%98,33 uyum). Bir örneğin Sanger ile NS5B dizisi 1b ile gruplanırken, 5’NCR dizisi ve YND ile NS5B ve 5’NCR dizileri 1a olarak

56 tanımlanmıştır. Sanger yöntemi ile elde edilen dizinin iyi okunan bölümlerinin kısa olduğu görülmüş, 1a olarak kabul edilmiştir.

Değerlendirmelerin sonucuna göre genotip dağılımı: 60 örneğin 43’ü genotip 1b (%71,67), üçü 1a (%5), yedisi 4 (%11,67), dördü 3 (%6,67), ikisi 5 (%3,33), biri 2 (%1,67) bulunmuştur.

5’NCR dizileri Stuyver’in (123) 1996 yılında 5’NCR dizileri ile genotip belirleme çalışmasına göre incelendiğinde; tanımlanmış bölgelere göre: altı örneğin genotiplendirmesi yapılamadı. 35 örnek genotip 1 olarak tanımlandı, ancak alt tip ayrımı yapılamadı. Dört örnek genotip 1b olarak tanımlandı; alt tip ayrımı bir örnekte R1 bölgesine göre, dört örnekte R4 ve R6 bölgesine göre yapıldı. Genotip 1a olarak tanımlanabilen örnek bulunmadı. Bir örnek genotip 2b olarak tanımlandı, alt tip ayrımı R2 ve R5 bölgelerine göre yapıldı. Dört örnek genotip 3 olarak tanımlanmış ancak alt tip ayrımı yapılamadı. Yedi örnek genotip 4 olarak tanımlanmış ancak alt tip ayrımı yapılamadı. İki örnek genotip 5 olarak tanımlanmıştır (genotip 5’e ait sadece bir alt tip bilinmektedir). Genotip 6 ve genotip 7 olarak tanımlanan örnek bulunmadı. Tablo 4’te örneklerimize ait sonuçlar toplu bir şekilde görülmektedir.

57 Tablo 4. Sanger ve YND ile belirlenen genotip sonuçları

HASTA NO NS5B SANGER 5’NCR SANGER 5’NCR STUYVER NS5B YND 5’NCR YND

1 1b 6 Belirsiz 1b 6 2 1b 1b 1a,1b 1b 1b 3 1b 1b 1a,1b 1b 1b 4 4d 4d 4 4d 4d 5 1b 1b 1a,1b 1b 1b 6 1b 1b 1a,1b 1b 1b 7 2b 2b 2b 2b 2b 8 5a 5a 5 5a 5a 9 1b 1b 1b 1b 1b 10 1b 1b 1a,1b 1b 1b 11 1b 1b Belirsiz 1b 1b 12 1b 1 1a,1b 1b 1 13 1b 1b 1a,1b 1b 1b 14 1b 1b 1b 1b 1b 15 1b 1b 1a,1b 1b 1b 16 3a 3a 3 3a 3a 17 1b 1b 1b 1b 1b 18 1b 1b 1a,1b 1b 1b 19 4d 4d 4 4d 4d 20 1b 1b 1a,1b 1b 1b 21 1a 1a Belirsiz 1a 1a 22 1b 1b 1a,1b 1b 1b 23 1b 1 Belirsiz 1b 1 24 1b 1b 1a,1b 1b 1b 25 1b 1b 1a,1b 1b 1b 26 3a 3a 3 3a 3a 27 1b 1a Belirsiz 1b 1a 28 1b 1b 1a,1b 1b 1b 29 1b 1b 1 1b 1b 30 1b 1b 1a,1b 1b 1b 31 4 4 4 4 4 32 3a 3a 3 3a 3a 33 1a 1a 1a,1b 1a 1a 34 5a 5a 5 5a 5a 35 1b 1b 1a,1b 1b 1b 36 1b 1b 1b 1b 1b 37 1b 6 1a,1b 1b 6 38 4d 4d 4 4d 4d 39 4d 4d 4 4d 4d 40 4 4 4 4 4 41 1b 1b 1a,1b 1b 1b 42 1b 1 1 1b 1 43 4d 4d 4 4d 4d 44 1b 1b 1a,1b 1b 1b 45 1b 1b 1a,1b 1b 1b 46 1b 1b 1a,1b 1b 1b 47 1b 1b 1b 1b 1b 48 1b 1b 1b 1b 1b 49 1b 1a Belirsiz 1a 1a 50 1b 1a 1a,1b 1b 1a 51 1b 1b 1a,1b 1b 1b 52 1b 1b 1a,1b 1b 1b 53 1b 1b 1a,1b 1b 1b 54 1b 1b 1a,1b 1b 1b 55 3a 3a 3 3a 3a 56 1b 1b 1a,1b 1b 1b 57 1b 1b 1a,1b 1b 1b 58 1b 1b 1a,1b 1b 1b 59 1b 1b 1a,1b 1b 1b 60 1b 1b 1a,1b 1b 1b

58 YND ile elde edilen verilerin analizine göre belirlenen HCV genotipleri:

NS5B bölgesi dizi analizi ile 60 örneğin 43’ü (%71,67) genotip 1b, yedisi (%11,67) genotip 4, dördü (%6,67) genotip 3, üçü (%5) genotip 1a, ikisi (%3,33) genotip 5, biri (%1,67) genotip 2 olarak saptandı. Şekil 10’da belirlenen HCV genotip oranları pasta grafiğinde gösterilmektedir.

Şekil 11. YND NS5B dizi analizine göre genotip dağılımı

5’NCR bölgesi dizi analizi ile ise, 60 örneğin 36’sı (%60) genotip 1b, yedisi (%11,67) genotip 4, dördü (%3,67) genotip 3, beşi (%8,33) genotip 1a, ikisi (%3,33) genotip 5, ikisi (%3,33) genotip 6, biri (%1,67) genotip 2 olarak saptandı. 5’NCR bölgesi dizi analizi ile üç örnek (%) alt tip ayrımı yapılamadan genotip 1 olarak belirlendi.

Her iki bölgenin analizine göre en çok saptanan genotip, genotip 1b oldu. Çalışmada genotip 7 olarak tanımlanan örnek olmadı. Tablo 5’te YND ile 5’NCR ve NS5B bölgeleri dizi analizine göre belirlenen genotip sayıları görülmektedir.

59 Tablo 5. YND 5’NCR ve NS5B bölgeleri dizi analizine göre belirlenen genotip sayıları

Genotip NS5B YND 5’NCR YND

1 (alttip belirlenemeyen) - 3 (%5) 1a 3 (%5) 5 (%8,33) 1b 43 (%71,67) 36 (%60) 2 1 (%1,67) 1 (%1,67) 3 4 (%6,67) 4 (%6,67) 4 7 (%11,67) 7 (%11,67) 5 2 (%3,33) 2 (%3,33) 6 - 2 (%3,33)

YND ve Sanger ile elde edilen diziler örnek bazında hizalandığında diziler arasındaki benzerlik oranları:

5’NCR bölgesi için dizilerimizin çoğunluğu YND ile 258 baz, Sanger ile 220 baz uzunluğundaydı. NS5B bölgesi için dizilerimizin çoğunluğu YND ile 378 baz, Sanger ile 338 baz uzunluğundaydı.

YND ile elde edilen 5’NCR dizilerinin uzunluğu Sanger dizileme ile elde edilen dizilerin uzunluğuna göre ortalama 38 baz, YND ile elde edilen NS5B dizilerinin uzunluğu Sanger dizileme ile elde edilen dizilerin uzunluğuna göre ortalama 40 baz daha uzundu.

5’NCR bölgesine ait dizilerde 60 örnekten 53’ünün (%88,3) %100 uyumlu, beşinin (%8,3) %99 uyumlu, birinin (%1,6) %98 uyumlu, birinin (%1,6) %97 uyumlu olduğu görüldü.

%100 uyum: 53/60 (%88,3) %99 uyum: 5/60 (%8,3) %98 uyum: 1/60 (%1,6) %97 uyum: 1/60 (%1,6)

60 NS5B bölgesine ait dizilerde 60 örnekten 45’i (%73,3) %100 uyumlu, beşi (%8,3) %99 uyumlu, biri (%1,6) %98 uyumlu, dördü (%6,6) %95-97 uyumlu, dördü (%6,6) %92-94 uyumlu, biri (%1,6) %83 uyumlu idi. %100 uyum: 45/60 (%73,3) %99 uyum: 5/60 (%8,3) %98 uyum: 1/60 (%1,6) %95-97 uyum: 4/60 (%6,6) %92-94 uyum: 4/60 (%6,6) %83 uyum: 1/60 (%1,6)*

*%83 uyumlu olan örnekte alt tip tanımlanması Sanger ve YND ile farklı olarak Sanger ile genotip 1b YND ile genotip 1a olarak yapıldı.

NS5B bölgesinin genotip veya alt tip ayrımını sağlayacak özel bölgelerin varlığı açısından dizilerin incelenmesi: Çalışmada elde edilen NS5B dizileri ve GenBank’tan alınan NS5B bölgesine ait referans dizileri hizalandı.

 8304-8306. nükleotidlerdeki ACG dizisinin tüm genotipler içinde sadece genotip 1a’da bulunduğu görüldü.

 Genotip 1 dizileri içinde alt tip ayrımı için diziler incelendiğinde; dizilerin tümünde; 8338., 8378. ve 8435. nükleotidlerin genotip 1a’da A olduğu genotip 1b’de C olduğu, 8355- 8357. nükleotidlerin genotip 1a’da GT olduğu genotip 1b’de CA olduğu, 8417. nükleotidin genotip 1a’da G olduğu genotip 1b’de C olduğu, 8521-8522. nükleotidlerin genotip 1a’da GG genotip 1b’de AA olduğu tespit edilmiştir. (Şekil 12)

61 Şekil 12. NS5B bölgesinde Genotip 1 için ayırt ettirici bölgeler

 Genotip 2: 8331-8332. nükleotidlerde TC bulunması ve 8364- 8366. nükleotidlerde CAC dizisi bulunması tüm genotipler içinde genotip 2’de ortaktı. (Şekil 13)

62

 Genotip 3: 8537-8539. nükleotidlerdeki CTT dizisi ve 8540-8542. nükleotidlerdeki TTG dizisi tüm genotipler içinde 3’te ortaktı. (Şekil 14)

Şekil 14. NS5B bölgesinde Genotip 3 için ayırt ettirici bölgeler

 Genotip 4: 8313-8317. nükleotidlerdeki GAGGT dizisi ve 8419. nükleotidde T bulunması tüm genotipler içinde genotip 4’e özgü olarak görüldü. (Şekil 15)

63 Şekil 15. NS5B bölgesinde Genotip 4 için ayırt ettirici bölgeler

 Genotip 5: 8300-8305. nükleotidlerdeki AATGAC dizisi, 8326-8327. nükleotidlerde CA bulunması, 8420-8423. nükleotidlerdeki CAAT dizisi, 8475-8481. nükleotidlerdeki TATGGGC dizisi, 8581-8584. nükleotidlerdeki GGCC dizisi ve 8598-8605. nükleotidlerdeki GAAGCGAG dizisi tüm genotipler içinde genotip 5’e özgü olarak görüldü. (Şekil 16)

64

 Genotip 6: 8331-8332. nükleotidlerde CC bulunması genotip 6’ya özgü olarak görüldü. (Şekil 17)

Şekil 17. NS5B bölgesinde Genotip 6 için ayırt ettirici bölgeler YND ile elde edilen diziler arasındaki uzaklık bulguları:

5’NCR: Çalışmamızda YND ile elde ettiğimiz 5’NCR dizilerini hizaladığımızda elde ettiğimiz sonuçlara göre; genotip 1b olarak tanımlanan 56 numaralı örnek ile genotip 3 olarak tanımlanan 55 numaralı örneğin %32,5 ile birbirlerine en uzak diziler olduğu gözlenmiştir. Tablo 6A’da 5’NCR YND ile elde edilen dizilerin evrimsel uzaklık ve benzerlik oranları görülmektedir. x ekseninde benzerlik, y ekseninde ise uzaklık oranları görülmektedir.

Genotip 1 dizileri arasında: Genotip 1 olarak tanımlanan diziler incelendiğinde birbirlerine en uzak dizilerin %4 ile genotip 1b olarak tanımlanan 1 numaralı örneğe ait 5’NCR dizisi ile ‘1b isolate HCV 201591’ isimli genotip 1b referans dizisi olduğu gözlenmiştir.

Bizim çalışmamızda elde ettiğimiz genotip 1 olarak tanımlanan diziler arasında ise %2 ile 56 ve 60 numaralı örneklerin birbirlerine en uzak diziler

65 olduğu gözlenmiştir. Bu örneklerin her ikisi de genotip 1b olarak tanımlanmıştır.

Genotip 1a olarak tanımlanan diziler ve referans diziler arasında birbirlerine en uzak diziler %1,5 ile 33 numaralı örnek ile ‘1a isolate HCV 201569 5’UTR’ isimli referans dizi olarak gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 1a olarak tanımlanan dört örneğin içinde ise 21 numaralı ve 33 numaralı örneklere ait diziler %0,7 ile birbirlerine en uzak olarak gözlenmiştir.

Genotip 1b olarak tanımlanan diziler ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %4 ile 1 numaralı örnek ile ‘1b isolate HCV 201591’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 1b olarak tanımlanan 36 örneğin içinde ise en büyük uzaklık %1,6 ile 1 numaralı ve 10 numaralı örnek arasında gözlenmiştir.

Genotip 2 olarak tanımlanan dizi ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %2,4 ile 7 numaralı örnek ile ‘2 isolate 2’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Çalışmamızda genotip 2 olarak tanımlanan bir tane örnek bulunmuştur.

Genotip 3 olarak tanımlanan dizi ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %9,9 ile 55 numaralı örnek ile ‘3 isolate 36’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 3 olarak tanımlanan dört örneğin içinde ise en büyük uzaklık %22,1 ile 26 numaralı ve 55 numaralı örnek arasında gözlenmiştir.

Genotip 4 olarak tanımlanan dizi ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %1,2 ile 40 numaralı örnek ile ‘4 isolate T80UTR’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 4 olarak tanımlanan yedi örneğin içinde ise en büyük uzaklık %0,8 ile 4 numaralı ve 40 numaralı örnek arasında gözlenmiştir.

66 Genotip 5 olarak tanımlanan dizi ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %1,2 ile 34 numaralı örnek ile ‘5 isolate ZADGM84801’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 5 olarak tanımlanan 8 ve 34 numaralı iki örneğin arasında ise farklılık gözlenmemiştir.

5’NCR dizi analizine göre genotip 6 olarak tanımlanan iki örnekten; 1 numaralı örnek ile genotip 6 referansları arasında en az %1, genotip 1b referansları arasında ise en az %0,8 uzaklık, 37 numaralı örnek ile genotip 6 referansları arasında en az %0,5, genotip 1b referansları arasında en az %0,4 uzaklık bulunmuştur. Genotip 6 referans dizileri ile genotip 1b referans dizileri arasından iki dizinin birbiri ile %100 uyumlu olduğu gözlenmiştir.

Genotip 7 5’NCR bölgesine ait dizi ile diğer genotiplere ait referans diziler karşılaştırıldığında; %11,4 ile ‘3 isolate c36’ isimli genotip 3’e ait diziye en uzak olduğu, %3,2 uzaklık oranı ile ‘1B 5'UTR Untitled Seq #1’ isimli diziye en yakın arasında olduğu gözlenmiştir.

NS5B: Diziler arasındaki en büyük uzaklık %53,5 ile genotip 1b olarak tanımlanan 59 numaralı örnek ile genotip 3 olarak tanımlanan 55 numaralı örnek arasında gözlenmiştir. Tablo 6B’de NS5B YND ile elde edilen dizilerin evrimsel uzaklık ve benzerlik oranları görülmektedir. x ekseninde benzerlik, y ekseninde ise uzaklık oranları görülmektedir.

Genotip 1 olarak tanımlanan diziler incelendiğinde birbirlerine en uzak dizilerin %26,4 ile genotip 1b olarak tanımlanan 20 numaralı örneğe ait dizi ile ‘1A NS5B Untitled Seq #1’ isimli genotip 1a referans dizisi olduğu gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda elde ettiğimiz genotip 1 olarak tanımlanan diziler arasında ise en büyük uzaklığın %25,5 olduğu ve genotip 1a olarak tanımlanan 33 ile genotip 1b olarak tanımlanan 36 numaralı örnek arasında bulunduğu gözlenmiştir.

67 Genotip 1a olarak tanımlanan diziler ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %8,7 olarak 21 numaralı örnek ile ‘1a isolate ZADGM3137 NS5B’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 1a olarak tanımlanan üç örneğin içinde ise en büyük uzaklık %6,6 ile 21 numaralı ve 33 numaralı örnek arasında gözlenmiştir.

Genotip 1b olarak tanımlanan diziler ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %12,1 ile 1 numaralı örnek ile ‘1b strain 09.80.009’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 1b olarak tanımlanan 43 örneğin içinde ise en büyük uzaklık %11,8 ile 20 numaralı ve 25 numaralı örnek arasında gözlenmiştir.

Genotip 2 olarak tanımlanan dizi ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %25,8 ile 7 numaralı örnek ile ‘2d isolate QC424 NS5B’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Çalışmamızda bir tane genotip 2 olarak tanımlanan örnek olduğundan genotip 2 için diziler arası farklılık incelenememiştir.

Genotip 3 olarak tanımlanan dizi ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %26,2 ile 55 numaralı örnek ile ‘3b isolate 07.22.218 NS5B’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 3 olarak tanımlanan dört örneğin içinde ise en büyük uzaklık %8,8 ile 26 numaralı ve 16 numaralı örnek arasında gözlenmiştir.

Genotip 4 olarak tanımlanan dizi ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %28,4 ile 40 numaralı örnek ile ‘4b isolate 433 NS5B’ isimli referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 4 olarak tanımlanan 7 örneğin içinde ise en büyük uzaklık %20,5 ile 31 numaralı ve 39 numaralı örnek arasında gözlenmiştir.

Genotip 5 olarak tanımlanan dizi ve referans diziler arasındaki en büyük uzaklık %8,1 ile 34 numaralı örnek ile ‘5a isolate 554 NS5B’ isimli

68 referans dizi arasında gözlenmiştir. Bizim çalışmamızda genotip 5 olarak tanımlanan 8 ve 34 numaralı iki örneğin arasında ise %5,1 uzaklık gözlenmiştir.

Çalışmamızda NS5B bölgesi dizi analizine göre genotip 6 veya genotip 7 olarak tanımlanan örnek yoktur.

5’NCR ile genotip 6 bulunan örneklerden 1 ve 37 numaralı örneklerin NS5B dizileriyle genotip 6 referans NS5B dizileri arasında sırasıyla; %58- 66,5 ve %59,8-65 uzaklık bulunurken, 1b referans dizileriyle %6,3-12 ve 4,2-8,4 uzaklık bulunmuştur.

Şekil 18 ve Şekil 19’da sırasıyla YND ile elde ettiğimiz 5’NCR ve NS5B dizileri ve NCBI GenBank’tan alınan referans dizileri ile oluşturulmuş filogenetik ağaçlar görülmektedir.

69 Şekil 18. YND 5’NCR dizilerine göre filogenetik ağaç

70 Şekil 19. YND NS5B dizilerine göre filogenetik ağaç

71 5. TARTIŞMA

Hepatit C virüsü enfeksiyonunda tedavinin ve uygulanacak olan tedavinin süresinin belirlenmesinde ve hastaya olan yaklaşımda genotip belirleme çok önemlidir. HCV genotiplendirmesi için altın standart yöntem hastadan elde edilen HCV genomuna spesifik PCR amplifikasyonu ürünlerinin dizi analizi yöntemi ile belirlenmesi ve filogenetik ağaç ile sınıflandırılmasıdır. Viral genomun tamamı kullanılarak yapılan tiplendirme ideal olmasına rağmen, bu pratik bir yöntem olmadığı gibi maliyeti de yüksektir. Bu yüzden çoğunlukla yeterli düzeyde farklılaşmış genom bölgesi PCR ile çoğaltılarak dizi analizi yapılmaktadır. Çalışmamızda 5’NCR ve NS5B bölgelerine ait diziler YND ve Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu olmak üzere iki nükleik asit dizileme yöntemiyle analiz edilerek, genotip belirlemedeki etkinliğin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

Hepatit C virüsü enfeksiyonunda tedavide ve bu tedavilere verilen yanıtlar ile direnç oranlarında genotipler hatta alt tipler arasında farklılıklar gözlenebilmektedir. Genotip 2 ve 3 enfeksiyonlarında tedavi süresi genotip 1 ve 4 HCV enfeksiyonlarının tedavi süresinden daha kısadır. Interferon + Ribavirin tedavisi için genotip düzeyinde belirlemek yeterli iken DEA’ların etkinliği ve bunlara karşı direnç gelişimi alt tipler arasında da farklılık gösterebildiği için bu tedavilerde alt tip düzeyinde belirleme gerekmektedir. Genotip 1b’nin proteaz inhibitörlerine direnci genotip 1a’dan daha düşüktür (28,119).

Genotip 1 kronik C hepatiti olan nonsirotik hastalarda Ombitasvir- Paritaprevir-Ritonavir ve Dasabuvir +/- RBV tedavisinin araştırıldığı PEARL- III ve PEARL-IV çalışmalarında genotipe göre kalıcı viral yanıt (KVY12) sonuçları incelendiğinde genotip 1a’daki KVY12 sonuçlarının ribavirin içeren ve içermeyen her iki tedavi yönteminde de genotip 1b ye göre daha düşük

72 olduğu gözlenmiştir (124). Genotip 1 kronik C hepatitine bağlı kompanse sirozlu hastalarda Ombitasvir-Paritaprevir-Ritonavir ve Dasabuvir + Ribavirin tedavisinin 12 hafta ve 24 hafta olmak üzere farklı sürelerde kullanıldığı TURQUOISE-II araştırmasında da iki farklı sürede de genotip 1b’de KVY12 sonuçlarının genotip 1a’ya göre daha yüksek olduğu bildirilmiştir (125). HCV genotip 1b, tedavi-naif veya deneyimli, kompanse sirotik hastalarda yapılan Ribavirinsiz Ombitasvir-Paritaprevir-Ritonavir ve Dasabuvir tedavisinin kullanıldığı TURQUOISE-III çalışmasında tedavi başarı oranları incelendiğinde erken virolojik yanıt (EVY) ve KVY12’nin %100 olduğu bildirilmiştir (126).

Genotipler arasında klinik gidişte de farklılıklar gözlenebilmektedir. Genotip 1b ve genotip 4’te hepatosellüler karsinom (HCC) gelişme riski diğer genotiplere göre daha yüksektir. En yüksek karaciğer HCV RNA seviyeleri ve HCV ile enfekte hepatosit sayıları genotip 1b ile enfekte hastalarda gözlenmektedir. İnterferon tedavisine yanıt vermeyen hastalarda bu iki parametrenin belirgin olarak yüksek olduğu gözlenmiştir. Genotip 1b, 2a, 2c ve 4’te, genotip 1a ve 3a’ya göre daha yüksek serum HCV RNA konsantrasyonları gözlenmektedir. Tedavi öncesi HCV RNA titresi düşük bulunan hastalarda tedaviye uzun dönem yanıt oranının, HCV RNA titresi yüksek olanlara göre daha fazla olduğu bilinmektedir (127–129).

Hepatit C virüsü genotiplerinin coğrafik dağılımının bilinmesi, epidemiyolojik çalışmalar, risk grupları ve enfeksiyonla mücadelede stratejileri geliştirilmesi açısından önem taşımaktadır. Özellikle 1a, 1b, 2a ve 3a gibi birkaç alt türün yaygın olarak dünyaya dağılmış olduğu ve yüksek gelirli ülkelerde HCV enfeksiyonlarının büyük bir bölümünü oluşturduğu tespit edilmiştir. “Epidemik alt tipler” olarak adlandırılan bu alt tiplerin, enfekte kan, kan ürünleri, enjekte edilen ilaç kullanımı ve diğer yollarla HCV’nin keşfinden önceki yıllar içinde hızla yayılmış olduğu düşünülmektedir. Pek çok HCV alt tipi “endemik alt tip” olarak kabul edilir; bunlar nispeten nadirdir ve daha kısıtlı bölgelerde görülmektedir: genotip 1 ve 2’den

73 kaynaklanan endemik suşlar özellikle Batı Afrika’da, genotip 3 Güney Asya’da, genotip 4 Orta Afrika’da ve Ortadoğu’da, genotip 5 Güney Afrika’da ve genotip 6 Güney Doğu Asya’da daha sık görülmektedir. Bugüne kadar bildirilen tek genotip 7 enfeksiyonu Orta Afrikalı bir göçmenden Kanada’da izole edilmiştir (10).

Dünya çapında HCV prevalansını ve genotip dağılımını göstermek için yapılmış bir derlemede, Amerika Birleşik Devletleri’ndeki HCV genotip dağılımları; en sık genotip 1 (%74.5), daha sonra genotip 3 (%10.6), genotip 2 (%10.2) ve genotip 4 (%1.7) olarak bildirilmiştir. Genotip 5 ve genotip 6 çok az görüldüğü için hesaplamaya katılmamıştır (130).

Almanya’da 2003 - 2006 yıllarında 10326 hasta ile yapılan büyük bir kohort çalışmasında, hastaların %61.7’si genotip 1b, %34.9’u genotip 2 veya 3 olarak tespit edilmiştir (131).

Yunanistan’da 2011 yılında yayınlanan ve 2817 hasta ile yapılan HEPNET kohort çalışmasında, hastaların %47’sinde genotip 1, %27’sinde genotip 3, %15.2’sinde genotip 4, %8.3’ünde genotip 2 saptanmıştır (132).

İran’da yapılan 1999 ve 31 Haziran 2014 tarihleri arasında yayınlanan ve 22952 HCV virüsü taşıyan bireyi içeren elli üç makalenin bulunduğu meta- analizde genotip 1a, %39 oranında ve baskın tip olarak belirlenmiştir; ardından 3a alt tipi %32, alt tip 1b %13, genotip 4 %5.18, ve genotip 2 %3.6 oranlarında bildirilmiştir (133).

Yemen, Kuveyt, Suudi Arabistan, Irak, Zaire, Gabon ve Gambia’da genotip 4 enfeksiyonlarının baskın olduğu bildirilmektedir (28).

Nepal, Bangladeş, Hindistan ve Pakistan’da tip 3a, Kuzey Afrika ve Orta Doğu’da tip 4 baskın genotiplerdir (134–136).

74 İlk kez 2002 yılında Saint Petersburg’da doğal bir HCV rekombinant formu tanımlanmıştır. Şimdiye kadar sadece rekombinant HCV genotip 2k/1b virüsleri aktif olarak dolaşımda bulunurken, genotip 2/5, 2b/1b, 2b/1a ve 2i/6p rekombinantları, Avrupa’da, İrlanda, Kıbrıs, Estonya, Almanya ve Fransa’da insanlardan tekli izolatlar halinde gösterilmiştir. Rekombinant