Metot

Bu çalışmada Mührüsüleyman (P. orientale) bitkisinin kök kısmı analiz edilmiştir. Mührüsüleyman bitkisini hem metanol/metilen klorür (1/1) hem de su ekstresinin antioksidan kapasitesi çalışılmıştır. Mührüsüleyman bitkisinin kökü güneş görmeyen yerde iyice kurutulmuştur ve toz haline getirildikten sonra metanol/metilen klorür ekstraksiyonu için 30 gr öğütülmüş Mührüsüleyman 150 mL çözücüde (1:1 metanol/ metilen klorür) numunelerin ekstraktları hazırlanmıştır. Su ekstresini hazırlamak için 5

gr mührüsüleyman 50 mL saf su ile ekstrakt hazırlanmıştır. Çözücüler uzaklaştırılarak ham ekstre elde edilmiştir.

Elde edilen her bir ekstraktın total antioksidan aktivitesi (Mitsuda ve ark., 1996), serbest radikal (DPPH·) giderme aktivitesi (Blois, 1958), Metal şelat oluşturma aktivitesi (Carter, 1971), Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi (Beauchamp ve Fridovich, 1971), İndirgeme gücü aktivitesi (Oyaızu, 1986), in vitro olarak ölçülmüştür ve total fenolik bileşik tayini spektroskopik olarak (Slinkard ve Singleton, 1977) yapılmıştır. Bu aktivitelerin her biri α-tokoferol (vitamin E), bütillenmiş hidroksi toluen (BHT) ve bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) gibi antioksidan maddelerin antioksidan aktiviteleri ile karşılaştırılmıştır.

Antioksidan testleri Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmı için üç tekrar yapılarak sonuçların ortalaması alınmıştır.

3.3.1. İndirgeme Gücü

Bitki ekstraktlarının total indirgenme gücü Oyaizu metodu kullanılarak belirlenmiştir (Oyaizu, 1986). 40, 80, ve 120 µl hacimlerindeki bitki ekstresinin (1 mg/mL) sudaki çözeltileri üzerine toplam hacim 2,5 mL olacak şekilde 0,2 M fosfat (KH2PO4 ) tamponu (pH: 6,6) ve 2,5 mL potasyum ferrisiyanür K3Fe(CN)6 (%1’lik) çözeltileri ilave edilmiştir. İyice vortekslendikten sonra 20 dk 50 oC’lik su banyosunda inkübe edilmiştir.

Daha sonra %10’luk trikloroasetik asit (TCA) çözeltisinden 2.5 mL bu karışıma eklenmiştir ve 10 dk 3000 rpm’de santrifüj edilmiştir. Santrifüjlenen karışımdan 2,5 mL alınıp üzerine 0,5 mL %1’lik demir(III) klorür (FeCl3) çözeltisi eklenerek vortekslenmiştir. Daha sonra UV-Vis spektroskopisi kullanılarak 700 nm’ de absorbansları ölçülmüştür. Kontrol ekstre dışında kalan kısımdır (2,5 mL tampon ile başlanır ve sırayla işlemler devam eder) α-tokoferol, BHT , BHA standartlarına da aynı işlemler yapılmıştır.

Reaksiyonlar sonrasında oluşan demir ferrosiyanür kompleksi (Şekil 3.1) miktarına göre antioksidan maddenin indirgeme gücü hakkında yorum yapılmaktadır. Demir

ferrosiyanür kompleksi 700 nm de absorbans verir; absorbans ile antioksidan aktivite doğru orantılı olarak değişmektedir.

Fe(CN)63- + Antioksidan Fe(CN)64- + Antioksidan+ + Fe3+ _Fe 4[Fe(CN)6]3

Şekil 3. 1. Demir ferrosiyanür oluşumu

3.3.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi

Bitki kökünün serbest radikal (DPPH•: 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil) giderme aktiviteleri Blois (1958) metoduna göre yapılmıştır. Stok çözeltilerden 50 µl, 100 µl, 200 µl mikropipetle deney tüplerine alınmıştır ve standartlardan da (BHT, BHA,α-Tok) 50 µl, 100 µl ve 200 µl alınmıştır. Daha sonra hepsi etanolle 500 µl’ye tamamlanmıştır. Toplam hacim 3 mL olacak şekilde tekrar etanol ilave edilmiştir. Daha sonra iki tane kontrol (3 mL etanol+1 mL DPPH çöz.) çözeltisi hazırlanmış ardından tüplerin hepsine kör hariç 1 mL DPPH çözeltisinden eklenmiştir. Toplam hacim 4 mL olacak şekilde etil alkol ilave edilmiştir. Işık görmeyen yerde otuz dakika inkübe edildikten sonra 517 nm de absorbans okunmuştur. Kör çözelti etil alkol, kontrol çözelti numunesiz çözeltidir (Blois, 1958).

DPPH• (1,1-Difenil 2-pikril hidrazil) serbest bir radikaldir, bir elektron veya hidrojen radikali alarak stabil diamanyetik molekül haline gelir. Bu metod, koyu menekşe renkli olan DPPH çözeltisinin, sistem içindeki herhangi bir molekül tarafından elektron transferi olduğunda renginin açılması ve bu renk değişikliğinin UV spektrometre ile

ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Renk ne kadar açılır ve çözelti absorbansı ne kadar düşük çıkarsa serbest radikal giderme aktivitesi o kadar artmaktadır.

Aşağıdaki formül kullanılarak % DPPH aktivitesi hesaplanmıştır. DPPH giderme aktivitesi (%) = [(A0-A1/A0)x100)]

A0: Kontrol Reaksiyonunun Absorbansı A1: Bitki Ekstraktlarının Absorbansı

3.3.3. Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi

Ekstrelerden 50 µl, 100 µl ve 200 µl olmak üzere farklı hacimlerde stok çözeltiler hazırlanmıştır ve bu hazırlanan ekstreler 500 µl olacak şekilde üzerlerine (pH 7,8) fosfat tamponundan ilave edilmiştir. Daha sonra hepsine kontrol 1, kontrol 2 ve kör dahil olmak üzere (0.05M,1 mL) metiyonin ilave edilmiştir. Sonra (1.5x10-5M,1 mL) riboflavin eklenmiştir. Daha sonra tekrar stok çözeltilerle 1,5 mL daha (kör ve kontrollere 2 mL) tampon çözeltisi ilave edilmiştir. En son 5x104 M.1 mL NBT ilave edilmiştir. Hepsi vortekslenmiş ve 20 UV’lik ışık kabininde 25 oC de 20 dk floresans ışıkta bekletildikten sonra ardından 560 nm’de absorbanslarına bakılmıştır.

Kör: Ekstre yok, ışık görmemiş, 1 mL metiyoninin, 1 mL riboflavin, 2 mL tampon, 1 mL NBT

Süperoksit giderme aktiviteleri riboflavin- metiyonin- ışık- NBT metoduna göre yapılmıştır (Beauchamp ve Fridovich, 1971). Süperoksit radikalleri (O2 - •) riboflavin /metiyonin/ışık sisteminde oluşturulup oluşan süperoksit radikalleri NBT’ yi NBT2+’ ye yükseltgemesi esasına dayanmaktadır. Oluşan formazan (NBT2+) ise 560 nm’de maksimum absorbans vermektedir. Sonuçlar antioksidan etkiye sahip olan bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) ve α-Tokoferol gibi standart antioksidan maddelerle karşılaştırılmıştır.

2 O2- + 2 H+ H2O2 + O2

3.3.4. Total Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi

Bitki ekstraktının antioksidan aktivitesini belirlemek için tiyosiyanat metodu kullanılmıştır. (Mitsuda ve ark., 1996). 1 mg/mL konsontrasyonda olacak şekilde hazırlanan stok çözeltiden, 0,5 mL alınarak vezin kaplarına ilave edilmiştir, üzerine 0,017 M 2,5 mL linoleik asit ve 0,04 M 2.4 mL tampon çözelti (pH:4.0, fosfat tamponu) eklenmiştir. Bu işlemler standartlar (BHA, BHT ve α-tokoferol) içinde yapılmıştır. Karışımlar 37 oC de 5-6 saat süreyle inkübasyona bırakılmıştı. Daha sonra deney tüplerine 4,7 mL etanol eklenmiş ve körede 4,8 mL etanol eklenmiştir. Üzerine vezin kaplarındaki numunelerden 100 µl eklenmiştir. Sonra hazırlanan bu deney tüplerinin her birine 100 µl FeCl2 çözeltisi ilave edilmiştir ardından %30’luk 100 µl amonyum tiyosiyanat eklenerek vortekslenmiştir. Vezin kapları tekrar etüve bırakılmıştır. En sonunda vortekslenen çözeltilerin 500 nm de absorbansları okunmuştur ve bu işlemler her 6 saatte bir tekrar edilmiştir. Kontrol çözelti olarak 2,5 mL linoleik asit üzerine 0,04 M 2,5 mL tampon çözelti konulmuştur. Kör ise numune dışındaki çözeltilerdir (etanol, amonyum tiyosiyanat).

Lipid peroksidasyon yüzdesi şu formülle bulunur (Mitsuda ve ark., 1996). % inhibisyon= ( A0-A1) / A0 x 100

A0: kontrol reaksiyonun absorbansı A1: numunelerin absorbansı.

3.3.5. Total Fenolik Bileşik Tayini

Bitki ekstreleride total fenolik bileşik tayini Folin-Ciocalteus reaktifi ile yapılmıştır (Slinkard ve Singleton, 1977). Gallik asit standart olarak kullanılmıştır.

50 mL’lik balon jojelere 1 mL numunelerden + 45 mL saf su ilave edilmiştir. Bu balon jojelerin hepsine Folin-Ciocalteus reaktifinden 1 mL eklenmiştir. Daha sonra hepsine %2’lıik 3 mL Na2CO3 eklenmiş ve karanlıkta 2 saat bekletilmiştir. Kör olarak; 45 mL su + 1 mL folin ciocalteu + 3 mL Na2CO3 (%2’lik) ile 50 mL ye su ile seyreltilmiştir. Fenolik bileşik tayininde gallik asitle hazırlanan standartlar ekstreler gibi inkübe edilmiştir. Total fenolik bileşik miktarı kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplanmıştır. A= 0.001 x Pyrocatechol(µg) + 0.0033

3.3.6. Metal Şelatlama Aktivitesi

Mührüsüleyman bitkisinin (kök) metal şelatlama aktivitesi Carter tarafından belirlenen metotla yapılmıştır (Carter, 1971). 40, 80 ve 120 µL’ lik konsantrasyonlardaki numuneler üzerine toplam hacmi 4 mL olacak şekilde etanol ilave edilmiştir. Daha sonra sırayla 2 µM 0,05 mL FeCl2 ve 5 µM 0,2 mL ferrozin eklenmiştir. 10 dk oda sıcaklığında bekletilmiştir. Kör için 2 µM 0,05 mL FeCl2 üzerine toplam hacim 4 mL olacak kadar etil alkol eklenmiştir. Standartlarada (α-tokoferol, BHA, BHT) aynı işlemler uygulanmıştır. 562 nm de spektrofotometrede ölçümler alınmıştır.

Metal Şelatlama Yüzdesi = ( A0 – A1 ) / A0 . 100 A0 : Kontrol Absorbansı

A1 : Numune Absorbansı

3.3.7. E Vitamininin (α-tokoferol)’ün HPLC ile Kantitatif Tayini

Kantitatif analiz Perkin Elmer Series 200 pompa ve Series 200 UV detektör’e sahip HPLC sistemi ile yapılmıştır. Hareketli faz olarak asetonitril (Çözücü A) (Merck, HPLC grade) ve deiyonize su (Çözücü B) kullanılmıştır. Ayrım için Dynex C18 ( 4.6 x 150 mm, 0.5 µm partikül büyüklüğü) kolon kullanılmıştır. Çalışma 295 nm’de ( Berenguer ve ark., 2002) yapılmıştır. Hareketli faz programı Çizelge 4.1’de verilmiştir.

Standart olarak α-Tokoferol (e vitamini) kullanılmıştır. Standartın metanolde 15 mg/mL stok çözeltileri hazırlanmıştır. Bu stok çözeltilerden seyreltme ile (metanol ile) 10, 50, 250 ve 1000 ppm’lik derişimlerden 20 µL hacimli enjektör ile cihaza verilmiştir. Şekil 4.8’de verilmiştir

Metanol/metilen klorür ve saf suda bulunan Mührüsüleyman bitki kökünün numuneleri petrol eteri ile ekstrakte edilmiştir. Üst faz (petrol eteri fazı) alınmıştır. Evaporatörde çözücü uzaklaştırılmıştır. Ham ekstrelere 1 mL petrol eteri ilave edilmiş ve süzüntü 0,22µm naylon membrandan (Chrom tech.) geçirildikten sonra 20 µL alınarak direkt olarak analiz edilmiştir.

3.3.8. Karotenoid (A vitamini) Spektroskopik Yöntemle Analizi

Karotenoid miktarı Elif ve arkadaşları (2010) tarafından kullanılan metoda göre yapılmıştır. 2007 ve 2009 yıllarına ait öğütülmüş Mührüsüleyman bitki köklerinden 0,2 gr tartıldı %80’lık 5 mL asetonda homojenize edilmiştir. 5 dk vortekslendikten sonra 3000 rpm’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatant kısımdan 1mL alınınarak 9 mL saf su ilavesiyle 10 kat seyreltilmiştir. Hazırlanan numuneler 645 nm, 663 nm ve 450 nm’de absorbansları ölçülerek kaydedilmiştir. Kör olarak %80’lık aseton kullanılmıştır.

Kla=12,7×A663 - 2,69×A645 }Arnon denklemi Klb=22,9×A645 - 4,68×A663 }Arnon denklemi