Metod Optimizasyonu

Akrilamid sulu çözeltide yüksüz polar bir moleküldür. Teorik olarak bir baz olduğundan çözücüden bir proton alarak pozitif olarak yüklenmesi beklenebilir. Ancak oluşacak konjuge asidin (HB+) pKa değeri, pKa,HB+˂ 0 olduğundan sulu

çözeltide normal pH değerlerinde (pH=1-14) protonlaşması beklenemez. Sulu çözeltide akrilamidi protonlamak ancak aşırı derişik kuvvetli asit varlığında (pH˂0) gerçekleşebilir. Oysa ki, CE’de bu kadar yüksek kondüktivitede ayırma ortamı kullanmak, ayırma elektrolitinde izin verilen elektrik akımın en üst sınır değerini (200 µA) aşar. Bu yüzden akrilamidi sulu ortamda yüküne bağlı olarak ayırmak mümkün değildir.

Akrilamidi CE’de ayırımı için bu çalışmada öngörülen prensip, akrilamidin pKa,HB+

sabitini mümkün olduğunca yükselterek ve böylece kuvvetli asitlerin düşük konsantrasyonlarını içeren susuz bir çözücü kullanarak, analitin protonlanmasını sağlayacak ayırım ortamını yaratmaktır. ACN ve metanol gibi CE çalışmalarında çokça kullanılan organik çözücüler içersinde asitlerin pKa değerleri sudakine göre

daha yüksektir. ACN ile metanol karşılaştırıldığında, ACN ortamındaki pKa artışı

metanole göre 2-3 kat daha fazladır [72]. Sonuç olarak, ACN’de suya kıyasla asitlerin asitlik sabiti (Ka) azalırken eşlenik bazlarının bazlık kuvveti artmaktadır.

Kolthoff ve Chantooni [73] bazı zayıf bazların ve amidlerin protonlaşma sabitlerinin logaritmik değerlerinin (logKfBH+) suyun yerini ACN aldığı zaman 5 ile 7 birim

26

arasında arttığını göstermişlerdir. Aslında Kolthoff’un verdiği tabloda logKfBH+

değerleri amidlerin protonlanmış şeklinin asitlik sabiti (pKa,HB+) ile aynı anlamdadır.

Akrilamidin sudaki ve ACN’deki pKa,HB+ sabiti literatürde bulunmamaktadır.

Kolthoff’un verdiği tablodaki diğer amidlerin değerlerine göre yorum yapılarak AA’in pKa,HB+ değerinin suda eksi ve ACN’de 3 katı veya fazlasına yükseleceği

öngörülmüştür. Şekil 5.1’de protonlanmış Benzamidin pH’a karşı Teorik iyonlaşma yüzdesindeki değişim görülmektedir.

Şekil 5.1: Protonlanmış benzamidin pH’a karşı teorik iyonlaşma yüzdesi [20]. Su yerine asetonitril kullanarak akrilamidi daha düşük konsantrasyonlarda kuvvetli asitler ile protonlamak mümkün olacaktır. Ancak burada başka bir engelleme ortaya çıkmaktadır. Bilindiği gibi, suda tamamen iyonlaşan kuvvetli Brönsted asitlerinin de (HCl, HI, H2SO4 vb.) ACN ortamında asidik kuvvetleri azalacaktır. Ancak perklorik

asit ACN’de hala kuvvetli elektrolit olarak davranır [74]. ACN içerisinde hazırlanmış 10 mmol/L sülfürik asit çözeltisine kıyasla aynı konsantrasyondaki perklorik asidin kondüktivitesi 30 kat daha fazladır [74]. O halde, AA’in protonlanması için asidik ortamı sağlayan ve kabul edilebilecek konsantrasyon değerlerinde kullanılabilecek asit HClO4 asittir. Ancak, perklorat iyonu (ClO4-) ACN

ortamında ACN ile hidrojen bağı oluşturmakta ve HClO4 nin dissosiyasyonunu

engellemektedir. Perklorik asit, asetik asit içerisinde hazırlandığı zaman aşağıdaki denklemde görüldüğü gibi CH3COOH2+ClO4- iyon çifti oluşturur ve bu iyon çifti

ACN ortamında tamamen disosiye olur [75].

CH3COOH─N≡C─CH3+ CH3≡N─H─ClO4 ↔ CH3COOH2+ + ClO4-

(su) (ACN) Iy o n la s m a Y ü z d e s i

27 5.2.1 Tampon Konsantrasyonun Seçilmesi

Đlk denemelerde 10 mmol/L HClO4 ACN içerisinde Bölüm 5.1.3’de anlatıldığı gibi

hazırlanmıştır. Bu tamponda CH3COOH konsantrasyonu 72,5 mmol/L’e denk

gelmektedir. Bu elektrolitin teorik pH değeri literatürde ̴ 2,1 olarak verilmiştir [20]. Akrilamidin gerek su da gerek ACN li ortamda pKa,HB+ değerleri bilinmediği için, bu

değerler literatürde belli olan iki amid ile karşılaştırılarak tahmin edilmeye çalışılmıştır. DMF’nin sudaki pKa,HB+ değeri literatürde -1,2 ile -1,13 [76,77]

benzamid için -2,16 ile -1,54 olarak verilmiştir [78,79]. Bu analitlerin pKa,HB+

değerleri ACN ortamında sırasıyla +6,1 ve +3,76’a yükselmektedir [73].

pH ̴ 2,1 ortamında DMF tamamen protonlaşırken benzamid kısmen protonlaşır ve her ikisi de CZE ortamında kendi elektroforetik hızları ile göç ederler. AA’in incelenen ayırma ortamında ne derecede protonlaştığı, pKa değerleri bilinen bu iki amid ile

beraberce enjekte edilerek kontrol edilmiştir. Denemelerde AA’nın bu iki amid arasında göç ettiği görülmüştür (Şekil 5.2c). Bu duruma göre AA’nın pH ̴ 2,1 ortamında kısmen HB+ formuna dönüştüğü ve ACN ortamında pKa,HB+ değerinin

+3,76 ile +6,1 arasında olduğu söylenebilir.

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0 50 100 150 200 250 300 5 4 2 3 3 2 1 c b a A b s o rb a n s ( m A u ) Zaman (dakika)

Şekil 5.2: AA’in üç farklı HClO4 konsantrasyonunda, ACN’de DMF ve benzamid ile birlikte elektroferogramları..(a) 30 mmol/L HClO4 , 218 mmol/L CH3COOH; (b) 20 mmol/L HClO4, 145 mmol/L CH3COOH; (c) 10 mmol/L HClO4 72,5 mmol/L CH3COOH. Voltaj: 25 kV(injeksiyon pozitif elektrottan yapılmıştır). Kapiler 75 µm, (52,5 x 44) cm; dalgaboyu: 200 nm; injeksiyon: Hidrodinamik 40 mbar, 6 s. 1= DMF; 2=AA; 3=BA Herbirinin konsantrasyonu 0,1 mmol/L.

28

AA’in DMF ve benzamidle birlikte elektroforetik davranışı 10, 20, ve 30 mmol/L HClO4 konsantrasyonlarındaki elektrolit çözeltilerde denenmiştir. Bu tamponlardaki

CH3COOH konsantrasyonları sırasıyla 72,5 mmol/L ; 145 mmol/L ve 218 mol/L’dir.

Artan HClO4 konsantrasyonlarıyla beraber pik simetrileri yükselmiştir. 7 mg/L AA

standartının üç farklı konsantrasyondaki pik yükseklikleri, rezolüsyon ve ayırma ortamının akım değerleri Çizelge 5.1 verildiği gibidir.

Çizelge 5.1 : HClO4 konsantrasyonlarına karşı pik ve akım değerleri.

HClO4 Pik Yüksekliği Pik Simetrisi Akım

10 mM 52,1 mAU 0,14 33 µA

20 mM 75,7 mAU 0,25 61 µA

30 Mm 86,5 mAU 0,55 91 µA

Elektroosmotik akış hızını belirlemek için sulu ortamda kullanılan nötral aseton, su ve formamid gibi işaretleyiciler ACN içinde düşük pH değerlerinde pozitif yüklenirler ve işaretleyici özelliğini kaybederler. Daha önce yapılan bir çalışmada nitrometanın %100 sülfürik asit içersinde dahi pKa,HB+ değeri ölçülememiştir [20].

Bu yüzden susuz ortamda elektroosmotik mobilite hesaplamaları için nötral işaretleyici olarak nitrometan kullanılmıştır. Elektroosmotik mobilite değerleri sırasıyla 10, 20 ve 30 mmol/L HClO4 içeren tamponlar için 23,9 ; 17,8 ve 14,5 ( x 10- 9 _m2_{/V.s ) olarak bulunmuştur. Perklorik asid konsantrasyonuna karşı üç amidin ve}

elektrosmotik akışın mobilite değişimleri Şekil 5.3’de verilmiştir.

Organik çözücüler kullanıldığında kapiler duvarındaki silanol gruplarının diğer zayıf asitler gibi davranması ve dissosiyasyonunun azalması beklenir. Elektrosmotik akışın yönünün metanol ortamında ve düşük pH’larda katoddan anoda doğru olduğu ve pH 7 civarında tersine döndüğü daha önce yapılan bir çalışmada gösterilmiştir [18]. Bu çalışmada da tüm denenen elektrolit konsantrasyonlarında elektroosmotik akış yönünün anodik (katoddan anoda doğru) olduğu gözlemlenmiştir.

29 10 15 20 25 30 -40 -20 0 20 40 60 80 M ob il it e (1 0 -9 m 2 V -1 s -1 ) [HClO₄] (mmol/L) DMF AA BA EOF

Şekil 5.3: Perklorik asit konsantrasyonunun elektroforetik ve elektroosmotik mobiliteye etkisi. Şartlar

Şekil 5.2’de verildiği gibidir...

Elektroosmotik akış ve elektroforetik mobiliteler, HClO4 konsantrasyonunun yanı

sıra tamponun su içeriği ve CH3COOH konsantrasyonundan da etkilenmektedir.

Aynı elektrolit çözeltisi ile yapılan bir çalışmada su içeriğinin % 2’den fazla olması durumunda elektroosmotik akışın yönünün anoddan katoda doğru değiştiği görülmüştür [20]. Bu çalışmada denemelerde kullanılan en derişik tampon çözeltide ( 30 mmol/L) dahi su içeriği %0,129 w/v değerini geçmediğinden EOF yönü daha önce belirtildiği gibi katoddan anoda doğrudur. Bu az miktarda su, ticari HClO4

çözeltisinin %100 lük asit çözeltisi olmaması nedeniyle, ana çözeltiden gelen az miktarda sudur.

Son olarak en uygun şartlarda, Akrilamidin iyonlaşması ACN yerine metanol içeren tampon ile de denenmiştir. AA tam olarak yüklenmemiş dolasıyla AA piki gözlemlenmemiştir.

5.3 Metod Validasyonu