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Para que se pudesse propor um processo extrativo em escala piloto havia necessidade de definir a seletividade de cada solvente a ser empregado, primeiramente em escala de bancada. A escolha do solvente extrator estava diretamente ligada a não alteração na composição química do vegetal, sendo então uma etapa crítica para realizar o processo de extração total. O objetivo era obter um extrato que contivesse a maior parte dos constituintes químicos do vegetal em estudo e não um extrato que se apresentasse somente constituintes químicos com uma determinada característica. No primeiro caso utilizamos solventes não seletivos como no caso de etanol e etanol:água. No segundo caso empregamos solventes seletivos, de menor polaridade como o hexano e o clorofórmio para retirada de graxas, ceras e substâncias apolares.

Optamos por utilizar uma metodologia moderna e eficiente, a extração por ultrassom (EU), que é definido como ondas sonoras com freqüências acima de 20.000Hz. A extração ultrassônica (sonicação) é a técnica que emprega essa energia, na forma de ondas, que criam variações na pressão do solvente extrator formando o fenômeno conhecido como “cavitação”, o qual provoca a formação espontânea de bolhas no solvente, mesmo em temperatura abaixo de seu ponto de ebulição. Estas bolhas rompem a tensão superficial e explodem gerando uma forte onda mecânica, fazendo com que a célula vegetal passe por uma interface poderosa de fricção, o que permite que o conteúdo intracelular seja extraído (SHARAPIN et al., 2000). O aumento da permeabilidade das paredes celulares, produção de cavitações e aumento do estresse mecânico no interior das células vegetais são os principais fatores geradores da extração por ultrassom (BUCHI et al., 1960)

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4.1.1 Avaliação da extração por ultrassom

Este estudo da técnica de extração das amostras das folhas, caule aéreo e caule submerso de G. elegans (Col1), consistiram em avaliar o efeito das variáveis da seletividade e quantidade de extrato obtido em relação à massa seca de cada órgão com diferentes solventes extratores.

A Tabela 6 descreve de forma geral o primeiro estudo de rendimento em massa seca de extrato das folhas, caule aéreo e caule submerso da espécie G. elegans. Os resultados foram obtidos nas condições experimentais de extrações conforme parte experimental item 3.3.1.1, considerando como variável de resposta a massa da extração. O rendimento foi calculado com base na massa do extrato em relação à massa da amostra utilizada nas extrações. A resposta da análise da seletividade (Figura 23) foi analisada por CCD, utilizando como fase móvel acetona:metanol (9:1, v/v). Foram aplicados os testes estatísticos para verificação da diferença entre as massas em gramas obtidas por cada método de extração através de ANOVA, descrita na Tabela 7.

Tabela 6. Rendimento de extratos obtidos por sonicação com diferentes solventes extratores para órgãos da espécie G. elegans

Sistema

Extrator Caule aéreo Caule submerso Folha

x ± S (g) CV % x ± S (g) CV % x ± S (g) CV %

SE 0,10 ± 0,01 d 6,51 0,22 ± 0,01 c 4,51 0,16 ± 0,01 c 7,12

SEA 0,37 ± 0,02 c 5,49 1,06 ± 0,05 b 4,49 0,98 ± 0,04 ab 4,57

SCAM 0,82 ± 0,02 b 5,77 1,25 ± 0,06 a 3,43 0,92 ± 0,02 b 1,20

SHCMA 0,90 ± 0,03 a 0,51 1,31 ± 0,04 a 7,11 1,03 ± 0,04 a 2,71 x= média das massas extraídas, S = desvio padrão, CV% Coeficiente de variação em %; As médias nas colunas seguidas pela mesma letra não diferiram uma da outra pelo teste de Tukey em 5% de significância.

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Tabela 7. Diferença entre médias dos tratamentos extrativos aplicados a espécie G. elegans, segundo a ANOVA

Órgãos Fonte de

variação

SQ gl MQ Fcalc. valor- P Fcrit.

Caule aéreo Entre grupos 1,308 3 0,436 1003,417 0,001 7,591 Dentro do grupo 0,003 8 0,001 Total 1,311 11 Caule submerso Entre grupos 2,263 3 0,754 279,939 0,001 7,591 Dentro do grupo 0,021 8 0,003 Total 2,284 11 Folha Entre grupos 1,517 3 0,506 449,490 0,001 7,591 Dentro do grupo 0,009 8 0,001 Total 1,526 11

SQ= soma dos quadrados; gl = graus de liberdade; MQ = mínimo quadrado; P = probabilidade; Fcal= calculado; Fcrit= crítico.

As análises estatísticas dos resultados indicaram que nos experimentos da folha e caule aéreo ocorreram diferenças significativas entre as metodologias dos diferentes extratores, já no caule submerso os sistemas misturas dos três solventes e sistema de solventes não apresentaram diferença significativa quanto rendimento de extrato sobre massa seca.

Mas como os valores de Fcalc são maiores que o Fcrit para os três órgãos

estudados, estatisticamente comprova-se que há diferenças entre os rendimentos em extratos secos obtidos para os diferentes solventes extratores. Alem disto, os órgãos apresentaram Fcalc diferenciados, o que mostra a influência dos solventes

extratores propostos sobre a matriz vegetal.

Os resultados demonstraram que a extração por ultrassom com o Sistemas de solventes (SHCMA) é método que produz a maior quantidade de extrato nos três órgãos analisados, seguindo-se do sistema de mistura dos três solventes (SCAM) nos órgãos caule aéreo e folha, logo a seguir os sistemas etanol:água (SEA), e por ultimo o sistema etanol (SE).

As propriedades exercidas pelo ultrassom facilitaram a dilatação e hidratação do material vegetal causando a abertura dos poros da parede celular e conseqüentemente ocorreu o aumento da razão de transferência de massa,

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resultando em melhor eficiência de extração e com redução do tempo de extração, conforme é relatado na Tabela 6, que mostra o rendimento em massa seca de vegetal/massa de extrato obtido das folhas, caule aéreo e caule submerso da espécie G. elegans, pelo sistema SHCMA.

Cuja justificativa é devida ao ataque efetivo à integridade das paredes celulares, pelos efeitos de pronunciados de cavitação, os quais não ocorrem com outras técnicas extrativas.

SILVA et al., 2002 relatam vantagens no uso da extração por ultrassom, sugerindo que o melhor desempenho da ultrassonicação se da sempre na comparação da relação massa do vegetal seco e a massa seca extraída.

O elevado rendimento da extração não irá garantir um alto rendimento de componentes bioativos no extrato. Alguns componentes bioativos tais como ácidos graxos livres e tocoferóis são muito sensíveis ao oxigênio e calor. Neste caso, mais cuidados devem ser tomados para evitar a oxidação e a degradação térmica dos componentes. Portanto, o rendimento e a quantidade dos componentes bioativos também devem ser considerados quando for selecionado um método de extração.

4.1.2 Análise cromatográfica em camada delgada dos extratos brutos obtidos com diferentes solventes extratores

Na interpretação das análises cromatográficas (Figura 21) foi perceptível que o sistema SHCMA permite uma melhor separação dos constituintes químicos.

A análise das variáveis da extração permitiu-se observar que existem outros fatores com efeito positivo na extração. As principais variáveis que influenciaram o processo de extração foram tempo de extração, polaridade crescente do solvente (razão massa de amostra por quantidade de solvente). Sendo assim, maior tempo de extração, maior quantidade de solvente e solvente com polaridade crescente produz maior quantidade de extrato, e contribui para uma eficaz previsão de classes dos compostos encontrados nesses extratos, em comparação com as demais técnicas de extração, como é relatado por Cechinel Filho e Yunes (1998).

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Figura 21. Análise cromatográfica em CCD dos extratos oriundos dos órgãos de G elegans 1.Extrato etanólico; 2.Extrato etanol/água; 3.Extrato clorofórmico; 4.Extrato metanol/água; 5. Extrato hexânico; 6.Extrato clorofórmico; 7.Extrato metanólico; 8.Extrato aquoso.