Frascos Erlenmeyers com capacidade para 250 mL, contendo quantidade variada do meio de cultura (90 mL, 135 mL, 180 mL), foram lacrados, esterilizados a 131 ºC por 15 minutos sendo, em seguida, submetidos à temperatura ambiente até atingir 40 °C. Na câmara de fluxo laminar, estes frascos foram inoculados com 10 % v/v do inóculo (MDS). Após a inoculação, os frascos foram levados ao incubador rotativo em diferentes condições, conforme matriz do planejamento fatorial, sendo suas variáveis de estudo: meio manipueira; velocidade de agitação e razão de aeração.
Em intervalos regulares, a cada 4 horas nas 12 primeiras horas de cultivo, passando a ser coletada a cada 12 horas até 132 horas de cultivo, amostras foram retiradas e centrifugadas para acompanhamento de pH, concentração de biomassa, concentração de substrato, variação da tensão superficial, índice de emulsificação (E24) do último ponto analisado para querosene comercial, diluição micelar crítica (DCM-1 e DCM-2) e extração do biossurfactante bruto.
O caldo produzido, após centrifugação, para cada ponto foi armazenado em coletores universais e congelados a -18 ºC.
3.5 – Análises
3.5.1 – Contagem de micro-organismo
Durante o cultivo, a cada quatro horas uma amostra era retirada para a contagem de células, essa contagem foi realizada através da contagem em placas passando previamente pelo método das diluições seriadas. De acordo com Vermelho et al. (2006), esse método é o principal para a contagem de células viáveis.
A partir de uma amostra recolhida, 1 mL é adicionado a 9 mL de solução salina estéril em sequência, obtendo-se diluições 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4. Para cada diluição, foram utilizadas duas placas, onde cada placa recebeu 1mL da amostra ou diluições em superfície em meio PCA (Plate Count Agar) previamente esterilizado em autoclave e distribuído assepticamente em placas de petri estéreis.
As placas foram levadas para estufa bacteriológica a 36 ºC por 3 a 5 dias. Em seguida, foi realizada a contagem na placa utilizando o contador de colônia (QUIMIS – Q295B), multiplicando o número encontrado por seu fator de diluição.
3.5.2 – Determinação da concentração celular
O método utilizado para quantificar a concentração celular foi o de massa seca (ou peso seco). Este método consiste em separar as células do meio, secá-las e pesá-las (Bezerra 2006; Lobato, 2003). As amostras retiradas do shaker foram centrifugadas em tubos
Eppendorfs de 2,0 mL a 16.464 x g (Nova Técnica – NT800) por 10 minutos. Os tubos Eppendorfs vazios eram previamente colocados em estufa (BIOPAR) a 70 °C por 24 horas até
Depois da centrifugação, o sobrenadante foi recolhido para outras análises. Nos tubos com a massa úmida foram adicionados 2,0 mL de água destilada para a lavagem e retirada de outros componentes solúveis ainda presentes. Após a segunda lavagem, as amostras foram colocadas na estufa a 70 °C por 24 horas. Corrido este tempo, os Eppendorfs foram colocados em dessecadores por 5 minutos e pesados. Cada ponto foi realizado em duplicata e o valor médio obtido considerado para os cálculos.
A quantidade de biomassa (g/L), mseca, foi expressa pela seguinte equação:
(16)
Onde:
T1 = Tubo com biomassa T2 = Tubo vazio
3.5.3 – Determinação da concentração de substrato
Na determinação da concentração de substrato utilizou-se o método do DNS (Miller, 1959). O método do DNS baseia-se na redução do ácido 3,5 dinitro-salicílico a ácido 3- amino-5- nitrosalicílico, ao mesmo tempo em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a grupo carboxílico com o desenvolvimento de coloração avermelhada, medida espectofotometricamente em 600 nm (Zanin et al.,1998).
No procedimento utilizou-se uma curva padrão de (glicose) principais produtos da hidrólise do amido.
Em um balão volumétrico de 25 ou 50 mL, adicionou-se 1,0 mL da amostra, 0,5 mL de HCl e 6,0 mL de água. A solução foi então aquecida a 70 ºC por 10 minutos, resfriada com água corrente e neutralizada com solução de NaOH 4,0 M, utilizando-se duas gotas de fenolftaleína como indicador. O balão foi completado com água destilada.
Após a hidrólise, tomou-se 0,5 mL desta amostra; 2,5 mL do reagente DNS foram adicionados e os tubos levados para o banho termostático à 100 ºC por 10 minutos. Em seguida, os tubos de ensaio foram deixados em água gelada por 3-5 minutos. Na sequência, 3,0 mL de água destilada foi adicionada, a solução foi agitada no vórtex e a absorbância a 600 nm foi medida.
Utilizou-se como branco uma amostra com 0,5 mL de água destilada no lugar de 0,5 mL da amostra hidrolisada. O valor obtido foi multiplicado pelo fator de diluição, neste caso 25 ou 50, dependendo do balão volumétrico utilizado.
Uma curva de calibração foi construída, correlacionando a concentração de glicose com a leitura da absorbância.
3.5.4 – Determinação da tensão superficial
A medida da tensão superficial é uma ferramenta comum e um método indireto para monitorar a produção de biossurfactantes. À medida que o micro-organismo cresce, ele sintetiza o biossurfactante e este metabólito é lançado ao caldo, reduzindo a tensão superficial. A tensão superficial foi medida no tensiômetro modelo alemão Kruss (K-6), que utiliza o método do anel. As análises foram realizadas com o sobrenadante obtido após a centrifugação da amostra bruta, a uma temperatura de aproximadamente 25 ºC. A cada início das análises, o anel foi esterilizado em bico de Bunsen e calibrado verificando a tensão superficial da água destilada, cujo valor é de aproximadamente 72,8 mN/m.
Foram realizadas três medidas para cada ponto em estudo, sendo considerada a média aritmética dos resultados.
3.5.5 – Estudos de estabilidade
Após traçar as curvas representativas para as medidas de tensão superficial para o sobrenadante e comparado os melhores resultados, os pontos que apresentaram os menores índices de tensão superficial foram levados a testes de estabilidade de pH, temperatura e salinidade.
3.5.5.1 – Estabilidade de pH
O pH do meio foi ajustado para diferentes valores de pH (2, 5, 8 e 10), utilizando a base NaOH (1 M) e o ácido HCl (1 M). Após 30 minutos, verificou a tensão superficial conforme descrito 3.6.4 (Nitschke, 2004).
3.5.5.2 – Estabilidade de temperatura
O sobrenadante foi aquecido a 50, 60 e 70 ºC por 24h em estufa, esperou-se esfriar em temperatura ambiente e verificou-se a tensão superficial pelo método do anel.
3.5.5.3 – Estabilidade de salinidade
O efeito da salinidade foi determinado variando a concentração de NaCl para 1, 5 e 10 % (p/v). As amostras permaneceram em repouso por 3 horas, verificando-se a tensão superficial em seguida (metodologia descrita em 3.6.4).
3.5.6 – Determinação da diluição micelar crítica (DMC-1 e DMC-2)
A concentração do biossurfactante produzido pode ser medida indiretamente através da diluição micelar crítica (DMC). Quanto menores os valores de DMC, maior a diluição necessária para causar mudança significativa na tensão superficial, portanto é maior a concentração de biossurfactante no meio.
Nesse caso, o sobrenadante é diluído em água destilada por 10 vezes (DMC-1) e 100 vezes (DMC-2) (Nitschke et al., 2004), determinando-se, em seguida, a tensão superficial conforme método apresentado anteriormente em 3.6.4.
3.5.7 – Determinação do pH
O acompanhamento do potencial hidrogeniônico (pH) foi verificado ao longo de toda a fermentação utilizando-se o potenciômetro HANNA INSTRUMENTS HI 221.
3.5.8 – Determinação do índice de emulsificação
A capacidade dos biossurfactantes, para emulsificar hidrocarbonetos, foi avaliada pelo índice de emulsificação do sobrenadante da amostra final do processo fermentativo. Este índice foi determinado de acordo com o método de Wei et al.(2005). Neste caso, 2,0 mL do sobrenadante foi adicionado em um tubo contendo 2,0 mL de querosene comercial. A mistura foi agitada em vórtex por 2 minutos e permaneceu em repouso por 24 horas.
O índice de emulsificação foi obtido pela seguinte relação:
(17)
Onde:
E24 = índice de emulsificação após 24h (%),
Hemulsão = Altura da emulsão
Ht = Altura total
Com o objetivo de avaliar a estabilidade por um tempo maior para a emulsão formada, o índice de emulsificação também foi verificado para o tempo de 48 e 72 horas para cada ensaio.
3.5.9 – Extração do biossurfactante bruto 3.5.9.1 – Precipitação ácida
Para esta análise, retirou-se 10 mL do sobrenadante centrifugado de cada ponto da cinética e acidificou com HCl 6,0 N até alcança pH 2,0. Em seguida transferiu-se 2 mL para tubos ependorffs (amostras feitas em duplicatas) acondicionando-as em geladeira por 12 horas a temperatura de 4 ºC. Após 12 horas (overnight), foram centrifugadas a 14000 rpm (16.464 x g) por 20 minutos, o sobrenadante foi extraído e medido a tensão superficial.
Os tubos com a massa precipitada seguiram para a estufa a 50 ºC por 24 horas. Os
pellets foram obtidos e suspendido em 2 mL de água e também armazenado.
3.5.9.2 – Extração por solvente
Para esta etapa, utilizou-se a extração com o éter de petróleo, visando extrair o biossurfactante através de sua porção lipídica.
Após a precipitação ácida (3.6.8), o sobrenadante obtido, armazenado em coletor universal estéril, foi colocado em um funil de separação onde foi adicionado 20 mL de éter de petróleo (1:1 v/v) para a extração do metabólito sintetizado.
Agitou-se o funil de separação por 20 segundos, passando a ficar em repouso por 30 minutos para a separação das fases. Este procedimento foi repetido três vezes para garantir a máxima extração do biotensoativo.
A cada ciclo de 30 minutos, o éter de petróleo contendo o biossurfactante era estocado em um béquer para posterior concentração do biossurfactante para a realização das análises colorimétricas de quantificação.
3.5.10 – Quantificação do biossurfactante
O biossurfactante obtido da fase orgânica foi levado ao rotaevaporador (R 215 – Buchi) para ser concentrado a uma temperatura de 40 ºC. O concentrado obtido foi ressuspenso em 20 mL de água destilada e guardado sob refrigeração. (Costa et al., 2006; Rashedi et al., 2005; Mata-Sandoval et al., 1999; Patel & Desai, 1997).
O concentrado ressuspendido seguiu para as próximas análises. De acordo com Heyd
et al. (2008), os métodos colorimétricos são os mais utilizados para a quantificação dos
ramnolipídeos. O método consiste na reação entre a molécula de ramnose e o colorante presente. Entre os métodos colorimétricos para a quantificação dos ramnolipídeos em termos
de ramnose destacam-se o método do orcinol, o método fenol-sulfúrico e o método que utiliza o ácido tioglicólico em sua composição.
3.5.10.1 – Método do orcinol
O método do orcinol (Chandrasekaran e Bemiller, 1980) é utilizado para avaliar diretamente a quantidade de glicolipídeo na amostra. Uma amostra de 333 L do sobrenadante é primeiramente extraída com 1 mL de dietil-éter, essa operação é repetida por mais duas vezes. As frações de éter são reunidas em um pequeno tubo de ensaio e evaporadas em temperatura ambiente. Adiciona-se em seguida 1 mL de água destilada. Para cada 100 L de amostra, adiciona-se 900 L de uma solução contendo 0,19% orcinol (em 53% (v/v) H2SO4). As amostras são aquecidas a 80ºC por 30 minutos e depois são esfriadas a temperatura ambiente (tempo de aproximadamente 15 min). Em seguida as amostradas são levadas ao espectrofotômetro a 421 nm.
As concentrações de ramnolipídeo foram calculadas a partir dos dados com os obtidos através de uma curva de calibração com os padrões ramnose entre 0,1 e 1 g/L.
3.5.10.2 – Método do fenol-sulfúrico
A quantificação indireta de ramnolipídeos também pode ser realizada pela medida de açúcares totais pelo método de DUBOIS et al. (1956). A metodologia consiste na adição de 0,5 mL do caldo livre de células em tubo de ensaio de vidro de 20 mL, seguido da adição de 0,5 mL de solução de fenol 5% (m/v). Acrescenta-se 2,5 mL de ácido sulfúrico concentrado. A mistura é então homogeneizada em um vórtex por 1 minuto e deixada em repouso por 15 minutos. Após esse período, faz-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 480 nm. A medida deve ser lida utilizando a água destilada (branco reacional).
A curva de ramnose foi construída utilizando-se uma solução estoque de ramnose padrão com 1 g/L em água destilada. A partir desta solução foram preparadas diversas diluições correspondentes as concentrações (g/L) para a construção da curva de calibração.
3.5.10.3 – Método do ácido tioglicólico
O método tioglicólico expressa em ramnose o biossurfactante (ramnolipídeo) sintetizado. O método consiste em adicionar 4,5 mL de ácido sulfúrico diluído (6:1) ao sobrenadante, agitando vigorosamente por 1 minuto em vórtex. A mistura é aquecida a 100 °C por 10 minutos e esfriada a temperatura ambiente. Depois de esfriada a temperatura ambiente, adiciona-se 0,1 mL de solução de ácido tioglicólico 3 % recém preparada à mistura, agita-se novamente em vórtex por mais 1 minuto. A mistura deve ser guardada em um local sobre
ausência de luz por 3 horas. Absorbância deve ser medida em 2 comprimentos de onda, a 400 e 430 nm utilizando-se o espectofotômetro (Rahman et al., 2002).
A concentração de ramnose é determinada a partir da diferença entre os dois comprimentos de onda (400 e 430 nm) usando-se curva de calibração, previamente determinada com ramnose comercial. A diferença é realizada porque o valor de absorbância obtido na leitura de 430 nm indica a interferência de outros açúcares. As medidas devem ser feitas em triplicatas e considerar à média entre elas. O valor obtido é multiplicado pelo fator 3,4, esse relaciona o ramnolipídeo em termos de ramnose, segundo Raza et al. (2007).
Capítulo 4
Resultados e
4. Resultados e discussão
Na presente tese utiliza-se a manipueira, resíduo agroindustrial de baixo custo e renovável na síntese de biossurfactantes. Nesse capítulo, apresenta-se e discute-se a caracterização da manipueira, avalia-se a melhor concentração da fonte carbono, bem como o tempo ótimo para a síntese do metabólito. Avaliam-se as condições operacionais para melhor produção do biossurfactante usando-se planejamentos fatoriais como ferramentas. Um estudo cinético é apresentado, enfatizando o comportamento do micro-organismo sob as diferentes condições de cultivos. Avalia-se a concentração do biossurfactante através da Diluição Micelar Crítica (DMC). Por fim, um estudo sobre o poder bioemulsificante (E24) do metabólito é apresentado como também a estabilidade do biossurfactante produzido em relação ao pH, temperatura e salinidade.
Os resultados são apresentados em oito tópicos: 4.1 – Caracterização da manipueira
4.2 – Avaliação da concentração inicial de substrato e do tempo ótimo para a inoculação
4.3 – Avalição da influência das condições operacionais de cultivo
4.4 – Estudo cinético para a Pseudomona aeruginosa AP029-GVIIA em manipueira como substrato
4.5 – Quantificação do biossurfactante sintetizado 4.6 – Avaliação da diluição micelar crítica (DMC) 4.7 – Avaliação do índice de emulsificação (E24)
4.8 – Análise da estabilidade do biossurfactante em relação à variação de pH, temperatura e salinidade.