Kümeleme algoritmaları

Apesar das propriedades serem comercialmente atrativas e vantajosas em relação aos surfactantes sintéticos, a produção econômica do biotensoativo apresenta diversas barreiras a serem derrubadas.

Entre estas barreiras pode ser citado o baixo rendimento e alto custo para a produção em grande escala, a necessidade de esterilização, problemas no controle do processo como a formação de espumas, problemas na recuperação e purificação do produto e a dificuldade em proceder à análise química dos produtos dada a natureza complexa do metabólito produzido (Bezerra, 2006; Healy et al.,1996).

De Acordo com Mukherjee et al.(2006), a economia de produção do biossurfactante é conduzida pelos seguintes fatores básicos:

I. custo inicial do material;

II. disponibilidade de procedimentos apropriados e econômicos da produção e de recuperação;

III. o rendimento do produto dos micro-organismos produtores.

Dessa forma, devem-se utilizar estratégias básicas para tornar o custo da produção de biossurfactantes competitivo, são elas (Fitcher, 1992):

a) uso de substratos mais baratos para reduzir os custos inicias do processo; b) desenvolvimento de bioprocessos eficientes, incluindo a otimização das

condições de cultivo e o custo de recuperação e separação máxima de biossurfactante;

c) o uso de mutantes e cepas recombinantes para altos rendimentos de biossurfactante.

Num processo fermentativo devem-se levar em consideração alguns pontos básicos: o micro-organismo, o meio de cultivo, a forma de condução do processo e as etapas de recuperação do produto final. É importante defini-los de forma conjunta, pois interagem entre si, levando em consideração os aspectos biológicos e econômicos.

2.4.1 – Micro-organismo

O êxito ou fracasso em um processo fermentativo começa com a escolha do micro-organismo. O micro-organismo escolhido deve apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto, permitindo o acúmulo do produto no meio, de forma a obter elevada concentração do metabólito no caldo fermentado. (Bezerra, 2006).

De uma forma geral, visando aplicações industriais, as principais características desejáveis para os micro-organismos seriam: elevada eficiência na conversão de substrato em produto, uma vez que as matérias-primas incidem significativamente no custo do produto final. Permitir a rápida liberação e acúmulo do produto no meio de cultivo, de forma a se obter em alta concentração, sem que o acúmulo do produto iniba o crescimento celular. (Bastos, 2010; Schmidell et al., 2001).

Da mesma forma, também se espera que outros produtos não desejáveis tenham sua produção minimizada durante o processo. Estabilidade quanto ao comportamento fisiológico; não ser patogênico; não exigir condições de processo muito complexas; não exigir meios de cultivo dispendiosos (Bastos, 2010).

O micro-organismo não deve exigir condições de processo muito complexas por motivos claros de economia na produção e como se pretende empregar meios de cultivos mais baratos, o micro-organismo deve encontrar condições adequadas para realizar a conversão pretendida (Schmidell et al., 2001).

O micro-organismo utilizado nos processos fermentativos é obtido através de isolamentos de fontes naturais como solo, água, plantas, etc., de coleções de culturas ou até mesmo de programas de melhoramento genético, no caso da produção de antibióticos (Schmidell et al., 2001). A modificação genética destes micro-organismos atribui certa especificidade aos mesmos, sendo então protegido por patentes. Isto significa que uma grande porcentagem de micro-organismos isolados ou modificados não está disponível para o uso geral em laboratórios (Bezerra, 2006).

2.4.1.1 – Pseudomonas aeruginosa como produtora de biossurfactantes A Pseudomona aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa podendo ser isolada de diferentes habitat, incluindo a água, o solo e plantas, esses bastonetes gram- negativos constituem a maior gênero de bactérias que existe em alimentos frescos. As

Pseudomonas são amplamente distribuídas entre os alimentos, especialmente verduras,

carnes, aves e produtos do mar. Eles são, de longe, o mais importante grupo que causam deterioração em alimentos quando refrigerado, pois muitas espécies são psicotróficas e seu crescimento é notável através de pigmentos verdes-azulados (Jay, 2005). É um patógeno oportunista humano que causa infecções nosocomiais sérias e também é resistente a antibióticos.

Fisiologicamente, Pseudomonas aeruginosa é classificada como uma bactéria aeróbia, podendo crescer anaerobicamente quando há presença de nitrato. Embora a espécie seja quimiorganotrófica, a obtenção de energia a partir de carboidratos implica um metabolismo oxidativo, ou seja, dependente de O2 (Lincopan & Trabulsi, 2008).

A versatilidade aos requerimentos nutricionais e energéticos permite que

Pseudomonas aeruginosa cresçam rapidamente em meios muito simples, numa ampla

Sob condições ambientais específicas essa bactéria produz um biossurfactante contendo ramnose – glicolipídeo (Sánchez et al, 2007), caracterizado como um ramnolipídeo. Há diversos fatores que influenciam no tipo de ramnolipídeo produzido, entre estes fatores podem ser citados a cepa bacteriana, a fonte do carbono utilizada e a estratégia do processo (Lang & Wullbrandt, 1999; Déziel et al., 1999).

Além de biossurfactante, a maioria das cepas produz pigmentos hidrossolúveis, difusíveis no meio de cultura, tais como a piocianina (azul); pioverdina (verde) e pigmentos em menor frequência como piomelanina (marrom) e piorrubina (vermelho) (Lincopan & Trabulsi, 2008).

2.4.2 – Meio de Cultivo 2.4.2.1 – Fonte de carbono

A fonte de carbono geralmente usada na produção deste metabólito pode ser proveniente de três categorias: carboidratos, óleos vegetais e hidrocarbonetos (Raza et

al.,2006; Kim et al, 1997). Fontes de carbono solúveis em água como glicose, manitol,

glicerol e etanol já foram estudados para a produção de ramnolipídeos por diversos tipos de Pseudomonas sp. As fontes de carbono imiscíveis como n-alcano e óleo de oliva apresentaram maior rendimento na produção do biotensoativo (Prommachan, 2002).

Na produção de biossurfactantes diversos substratos de fontes renováveis, especialmente os de indústrias geradoras de resíduos, têm sido utilizados para o cultivo de micro-organismo e produção de biossurfactante em escala experimental (Bezerra, 2006; Nitschke et al., 2005). Todavia, o principal problema encontrado para o uso de substratos alternativos como meio de cultura é encontrar um resíduo que tenha alto valor de nutrientes e que permita além do crescimento celular a acumulação do produto (Bezerra, 2006; Nitschke et al., 2005; Makkar & Cameotra, 2002).

A utilização de resíduos agroindustriais de baixo valor agregado é importante na redução do custo da produção de biossurfactante e na economia do processo, chegando a reduzir cerca de 50 % do valor do produto final (Gautam & Tyagi, 2006).

Efluentes provenientes da extração do óleo de oliva, gordura animal, óleo de fritura, soapstock (um coproduto de refinaria de óleo vegetal), melaço, soro do leite e outros resíduos ricos em amido (Maneerat, 2005; Desai & Banat, 1997) têm sido utilizados como substrato para a produção de biossurfactante. Além da própria

manipueira, vários outros substratos agroindustriais já foram investigados: semente de soja, açúcar de beterraba, batata doce e batata inglesa. Além de outros resíduos como: farelo e palha de trigo e de arroz; casca de soja, de milho e de arroz; bagaço de cana-de- açúcar e de mandioca, resíduos da indústria de processamento de café, como a polpa de café; resíduos da indústria de processamento de frutas como polpa de maçã e de uva, sobras do processamento de abacaxi e de cenoura, sobras de banana; sobras provenientes de moinhos de processamento de óleos como o de coco, de soja, de amendoim e de canola (Mukherjee et al., 2006; Makkar & Cameotra, 2002; Rahman et

al., 2002).

O uso de óleo de buriti, cupuaçu, óleo de maracujá, andiroba, castanha do Pará e babaçu para a síntese de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa LB1 foram testados, havendo uma excelente redução da tensão superficial como também uma boa emulsificação para os óleos extraídos do maracujá e castanha do Pará (Costa et al., 2006).

Na Tabela 2.2 são apresentados alguns substratos de baixo custo que são utilizados como fontes de carbono na produção de biossurfactantes.

Tabela 2.2 – Substratos de baixo custo utilizados na produção de biossurfactante Substratos de baixo

custo Biossurfactante Micro-organismo

Rendimentos (g/L) Óleo de Babassu soforolipídeo Candida lipolytica IA

1055 -

Óleo de soja e

girassol ramnolipídeo

Pseudomonas

aeruginosa DS10–129 4,31 / 2,98

Óleo de girassol lipopeptídeo Serratia marcescens - Óleo de fritura

(girassol e soja) ramnolipídeo

Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 2,7 Resíduos de refinaria de óleo glicolipídeo Candida antarctica

e/ou Candida apicola 10,5 / 13,4

Efluente do processamento de batata

lipopeptídeo Bacillus subitillis -

Manipueira lipopeptídeo

Bacillus subtilis ATCC 21332 e

Bacillus subtilis LB5a

2,2 – 3,0 Fonte: Mukherjee et al. (2006).

Entre as fontes alternativas de carbono e de baixo custo, destaca-se a manipueira, um efluente gerado em grande quantidade extraído da mandioca no processo de fabricação de farinha. Os principais nutrientes presentes neste resíduo são sais minerais e açúcares (Nitschke & Pastore, 2006).

2.4.2.2 – Mandioca e manipueira

A mandioca é uma raiz com alto teor de amido cultivada na América Tropical há mais de 5000 anos. A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é originária do Brasil, região amazônica fronteiriça com a Venezuela e se constitui em alimento energético para mais de 400 milhões de pessoas no mundo, sobretudo nos países em desenvolvimento, onde o cultivo é realizado por pequenos agricultores, em áreas reduzidas e com baixa produtividade (Cangnon et al., 2002).

Em área cultivada a mandioca ocupa o 7º lugar no mundo e o 4º nos trópicos. (Cangnon et al., 2002). Em conjunto com o Brasil, os países Paraguai, Colômbia, Peru e Bolívia respondem por quase 95 % da produção latino-americana. Sendo a mandioca de fácil adaptação, ela é cultivada em todos os territórios brasileiros (Cardoso & Sousa, 2002).

A mandioca é uma das culturas mais difundidas nas regiões Norte e Nordeste do Brasil. Inicialmente usada como alimento de índio, passou a ser o sustento dos europeus que não podiam cultivar o trigo (Mattos et al., 2002). As regiões Norte e Nordeste destacam-se como principais consumidoras, sendo a produção essencialmente utilizada na dieta alimentar, na forma de farinha. Nas regiões Sul e Sudeste, em que os rendimentos médios são foram 18,7 toneladas/semestre e 17,1 toneladas/semestre, respectivamente, a maior parte da produção é orientada para a indústria, principalmente nos Estados do Paraná, São Paulo e Minas Gerais. (Cardoso & Sousa, 2002).

Uma das características das plantas de mandioca é a presença de um glicosídeo (tipo de açúcar) potencialmente hidrolisável liberando cianeto (HCN). A hidrólise não é evidente e só se realiza naturalmente quando ocorre livre uma enzima da própria planta. Se a hidrólise não ocorre, o glicosídeo, tecnicamente denominado linamarina, é estável e inócuo. A Manihot sculenta Crantz é a espécie mais conhecida por acumular este glicosídeo. (Cangnon et al.,2002).

A liberação de HCN por plantas cianogênicas, como a mandioca, ocorre com velocidade significante somente após o tecido ser dilacerado e o glicosídeo cianogênico

entrar em contato com as enzimas catabólicas. No caso específico do glicosídeo linamarina, a primeira etapa é catalisada por uma -glicosidase nomeada linamarase. A clivagem produz glicose e acetonacianoidrina que se dissocia espontaneamente em pH maiores que 5.0, ou por ação da hidroxinitrila liase (HNL), formando HCN e acetona. (Cangnon et al., 2002). A Figura 2.10 apresenta a cianogênese a partir da linamarina.

Figura 2.10 – Cianogênese a partir da linamarina Fonte: Cangnon et al.(2002).

No caso específico da mandioca, a linamarase e HNL estão localizadas nas paredes celulares das folhas, em contrapartida, linamarina e lotaustralina encontram-se compartimentalizadas em vacúolos (Sayre, 1995 apud Cangnon et al.,2002).

No Brasil, há duas estruturas importantes para a produção de farinha. A primeira estrutura é conhecida como farinheira, uma agroindústria que apresenta trabalho profissional. A segunda estrutura apresenta alto índice de informalidade e não possui marca própria, são conhecidas como casas de farinhas, estruturas menos profissionalizada, baseadas geralmente em trabalho familiar (Granco et al., 2005).

A manipueira é o principal efluente, em termos de agressão à natureza, produzido pelas casas de farinha e pelas farinheiras. De vocábulo indígena incorporado à língua portuguesa, manipueira é o suco ou água de constituição das raízes, de aspecto leitoso, de cor amarelo-clara que é extraída das raízes carnosas da mandioca (Manihot

esculenta Crantz) por ocasião da prensagem das raízes frescas, picadas ou massa ralada

da indústria da Farinha (Cordeiro, 2006; Oliveira, 2003). Este efluente residuário foi sempre desprezado sem qualquer aproveitamento econômico. (Pantarotto & Cereda, 2001).

A preocupação com esse resíduo deve-se ao fato de que a produção da farinha de mandioca gera entre 267 a 419 litros desse resíduo para cada tonelada de raiz processada. Esse volume é extremamente elevado quando se considera o total gerado no

processamento em farinheiras e fecularias, 80 % das 26,6 milhões de toneladas de mandioca produzidas no Brasil em 2006 (Rossmann, 2008).

De acordo com Cordeiro (2006), este efluente de cor amarelada possui uma composição química variada que está associada à variedade da mandioca utilizada, ao período da safra, à fertilidade do solo, entre outros fatores. A manipueira é constituída por carboidratos, nitrogênio e diversos sais minerais que tornam este resíduo passível de ser aproveitado para o cultivo de micro-organismos.

Este efluente tem sido observado como um subproduto passível de ser aproveitado em outras atividades. Na gama de opções para o seu aproveitamento, encontra-se a produção de biomassa lipídica na qual o mesmo é utilizado como substrato. O estudo de tal alternativa fundamenta-se no fato de que a levedura

Trichosporon sp, considerada levedura oleaginosa, é encontrada naturalmente na

manipueira, estando adaptada a este resíduo. Entre os possíveis usos que estão sendo investigados para a manipueira encontram-se a produção de biogás, ácido cítrico e ferti- irrigação e produção de biossurfactante (Nitschke, 2002; Pantarotto & Cereda, 2001).

Na Tabela 2.3 é apresentada a composição da manipueira em alguns trabalhos publicados.

Tabela 2.3 – Composição da Manipueira

Componentes Concentração1 Concentração2 Concentração3

Sólidos Totais (g/L) * * 45,02 Açúcares totais (g/L) 35,3 56,4 47,07 Açúcares redutores (g/L) 12,8 * 0,35 Açúcares não-redutores (g/L) 22,2 * 47,03 Nitrogênio total (g/L) 2,5 * 0,21 Fósforo (mg/L) 225,9 900 643 Potássio (mg/L) 2.665,1 3.600,00 49 Cálcio (mg/L) 272,5 * 352,00 Magnésio (mg/L) 519,0 500,00 8,12 Enxofre (mg/L) 104,0 * * Ferro (mg/L) 7,8 6,1 ND Zinco (mg/L) 7,3 11,1 * Manganês (mg/L) 1,8 4,1 0,16 Cobre (mg/L) 0,6 14,1 * pH 5,9 * 4,56

1_{Fonte: Nitschke & Pastore (2006)} 2_{Fonte: Costa et al. (2009).} 3_{Fonte: Rossman (2008).}

* Análise não realizada

O processo da fabricação da farinha começa com a colheita da mandioca, que ocorre entre 16 e 20 meses após o cultivo. O tempo máximo após a colheita até a

fabricação deve ser de 36 horas para que a mandioca não entre em reações de escurecimento ocasionando um aspecto desagradável como também indevida para a produção da farinha. Esse processo é apresentado através da Figura 2.11.

Mandioca Seleção Lavador Descascador Triturador Água Prensa Esfarelador Forno Peneira Farinha Farelo Água de lavagem Cascas, Areia Manipueira

Figura 2.11 – Extração da manipueira em processo de fabricação de farinha

Após o descarregamento, a mandioca é selecionada e descascada. Nesta mesma etapa, as mandiocas são lavadas para a retirada de areia e resíduos da casca.

O passo seguinte é o triturador, uma máquina geralmente elétrica, que mói a mandioca, deixando em forma de grãos. Após a moagem, esta farinha que contém muita umidade é levada à prensa. Na prensa, da mandioca triturada é extraído o suco amarelado, com odor característico, a manipueira (Figura 2.12).

A massa prensada, em forma de blocos, segue para um tanque onde é esfarelada. Operários se encarregam de quebrar esta massa compactada utilizando ferramentas diversas como ciscadores, pás e até mesmo as mãos, tornado a massa homogênea antes de levar ao forno.

No forno, a massa esfarelada perde toda a água e enquanto é torrada, pás estão sempre homogeneizando para que a farinha produzida seja a mais uniforme possível.

Na última etapa encontra-se o peneiramento. O retido na peneira é denominado farelo, podendo ser retriturado em outro equipamento para depois ser novamente

peneirado. O peneirado é o produto final, a farinha, que logo em seguida é pesada e ensacada estando pronta para o consumo.

Figura 2.12 – Obtenção da manipueira

2.4.2.3 – Fonte de nitrogênio

Outros constituintes além da fonte de carbono também afetam a produção de biossurfactantes e a fonte de nitrogênio e/ou nitrogênio limitante tem um papel importante na síntese destes metabólitos (Desai & Banat, 1997). Pseudomonas utilizam nitratos, amônias e aminoácidos como fonte de nitrogênio (Mulligan & Gibbs, 1989).

Na produção de biotensoativos por Bacillus subitilis, Makkar & Cameotra (1997) estudaram o efeito de diversas fontes de nitrogênio (ureia, peptona, extrato de levedura, estrato de carne, triptona, nitrato de potássio, nitrato de sódio e nitrato de amônio), onde a ureia apresentou a melhor influência no rendimento do biossurfactante uma menor tensão superficial do meio em estudo.

De um modo geral, adicionar aminoácidos ou hidrolisados de proteínas favorece o crescimento da maioria dos micro-organismos heterotróficos. Deve-se considerar o custo, a sua disponibilidade, e os problemas de impureza que acompanham estas fontes (Desai & Banat, 1997).

Abouseoud et al. 2008, utilizando Pseudomonas fluorescens, mostraram que os melhores resultados na produção de biossurfactante e no crescimento da bactéria foram obtidos com o fornecimento de nitrato de sódio, entre as três fontes de nitrogênio testadas (cloreto de amônio, nitrato de amônio e nitrato de sódio). Esses autores

ressaltam a necessidade de controle desse nutriente para se obter altas concentrações de biossurfactante.

2.4.2.3 – Sais e minerais

Na maioria das vezes, produtores de metabólitos de interesse industrial produzem esses metabólitos em níveis baixos fazendo-se necessário o incremento de nutrientes para uma maior rentabilidade do processo.

A produção de biossurfactantes é influenciada não só pelas fontes de carbono e nitrogênio. A composição de outros nutrientes ao meio de cultura como fósforo, ferro, manganês e magnésio também contribuem para o rendimento da síntese do metabólito (Fontes et al., 2008).

A adição de extrato de levedura e a adição de licor de milho também exercem influência positiva (Schmidell et al., 2001). Traços de elementos como zinco, manganês, molibdênio, cobalto, cobre e cálcio podem ser requeridos pelos micro- organismos na síntese dos produtos.

A carência destes minerais ocorre geralmente em níveis baixos e podem, algumas vezes, ser suprida pela própria água ou por resquícios encontrados nos equipamentos. Traços dos elementos acima citados podem contribuir para produção de metabolismos tanto primários quanto secundários (Kampen, 1997).

Makkar & Cameotra (1997) reportaram que o B. subtilis aumentou a produção do biossurfactante em diferentes concentrações de NaCl (0,01-4,0 %). Para as altas concentrações de NaCl no meio, não houve efeito na capacidade do micro-organismo crescer e sintetizar o biosurfactante, porém a biosíntese foi reduzida a 4,0 % de NaCl.

A concentração de ferro pode induzir como reprimir a produção de ramnolipídeo por Pseudomona aeruginosa. De acordo com Abu-Ruwaida et al. (1991), ao reduzir a concentração de ferro de 36 μM para 18 μM no meio, acarretou em um aumento de 3 vezes na produção de biossurfactante. Cooper et al. (1981) mostraram que para a produção de biossurfactante utilizando o B. subtilis se faz necessária uma alta concentração de ferro (1,3 x 10-3M), embora, maiores concentrações de ferro não implicou em um aumento no rendimento da produção do metabólito.

2.4.3 – Efeito de fatores ambientais na produção de biossurfactantes Fatores ambientais e as condições de crescimento, também conhecidos como operacionais, tais como o pH, a temperatura, a agitação e a disponibilidade do oxigênio afetam também a produção de biossurfactante com seus efeitos no crescimento celular ou na atividade (Fontes et al., 2008; Gautam & Tiagy, 2006; Desai & Banat, 1997).

a) pH

Os micro-organismos podem crescer em uma faixa de pH que varia de 2,0 para os acidófilos até pH 11,0 para os alcalófilos e independentemente do pH que o micro- organismo seja capaz de suportar, se faz necessário conhecer o pH ótimo para o crescimento deste.

Os fungos têm pH ótimo em torno de 5,0, enquanto as bactérias têm pH ótimo por volta de 7,0. Variações de 0,5 para mais ou para menos não apresentam grandes variações no crescimento. Alguns micro-organismos modificam o pH do meio de cultivo durante seu crescimento, tornando necessária a inclusão de soluções tampão a fim de garantir que o pH mantenha-se dentro dos limites ótimos para crescimento e formação do produto esperado (Franco & Landgraf, 2003).

Estudos realizados por Reiling et al. (1986) utilizando Pseudomonas sp. para a produção de ramnolipídeos e variando a faixa de pH do meio, mostraram que a maior produção ocorreu na faixa entre 6,0 e 6,5. Quando modificado para pH acima de 7,0; foi verificado um decréscimo acentuado na síntese do biossurfactante. Contudo, o trabalho publicado por Cooper e Goldemberg (1987) apresentou que a síntese de surfactina por

Bacillus sp. não era afetado ao se elevar o pH de 6,5 para 7,0.

b) Temperatura

A temperatura tem uma grande influência no crescimento dos micro-organismos. Não é de se surpreender, uma vez que todos os processos de crescimento são dependentes das reações químicas que são afetadas pela temperatura. Micro-organismos podem crescer em uma ampla faixa de temperatura. Entretanto, esta variação pode ser maior para alguns do que para outros. A temperatura na qual uma espécie de micro- organismo cresce mais rapidamente é conhecida como temperatura ótima de crescimento (Pelczar Júnior et al., 2009).

Estudos publicados por Gautam e Tyagi (2006) apresentaram que um micro- organismo termofílico Bacillus sp. Foi capaz de produzir biossurfactante em temperaturas acima de 40 °C. O metabólito produzido não alterou suas propriedades surfactantes quando foi submetido à autoclave a 115 °C por 15 minutos.

c) Agitação e aeração

Uma das consequências da agitação é promover melhor aeração do meio, favorecendo o crescimento de micro-organismos aeróbios e facultativos. Além disso, a agitação auxilia na dispersão dos nutrientes e em sua homogeneização, favorecendo o crescimento dos micro-organismos (Schmidell et al., 2001).

A velocidade de agitação é um parâmetro importante para otimização da produção de biossurfactante, quando produzidos por micro-organismos aeróbios e isto depende tanto do reator utilizado quanto do micro-organismo. O aumento na velocidade de agitação pode diminuir a produção de biossurfactante devido ao efeito de cisalhamento na parede celular, influindo na cinética de crescimento do micro-