BÖLÜM 3: YÖNTEM VE SAHA ARAŞTIRMASI
3.3. Materyal ve Yöntem
3.5.1. Síntese de cDNA a partir da amplificação de RNAm
A metodologia utilizada para amplificação do RNAm seguida de síntese de cDNA dupla-fita foi baseada na metodologia proposta por Saraiva e colaboradores (2006). Para a síntese da primeira fita de cDNA a partir de RNA total o RNA foi incubado com 0,75 µg de oligonucleotídeo oligodT-T7
[5’AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCT(24)3’],
que contém o sítio da enzima T7 RNA polimerase, em volume final de 6 µl
por 10 minutos a 700C. Foram adicionados 1X de tampão First Strand Buffer;
0,01 M DTT; 1 mM dNTP; 1,5 µg de oligonucleotídeo TS (5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG3’); 40 unidades da enzima
RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega) e 400 unidades da enzima
incubada a 420C por duas horas. Em seguida, a síntese da segunda fita de
cDNA foi realizada com reagentes do Advantage® cDNA PCR Kit (Clontech). Foram adicionados ao cDNA simples-fita 1X Advantage PCR Buffer; 1 mM dNTP; 1,4 unidades da enzima ribonuclease H (RNAse H, Invitrogen); 1X
Advantage Polimerase Mix, em volume final de 100 µl. A reação foi incubada
a 370C por 10 minutos; 940C por 3 minutos; 650C por 5 minutos e 750C por 30 minutos. Para inibir a ação das enzimas foram adicionados 50 mM NaOH e
0,1 mM EDTA e a solução incubada a 650C por 10 minutos. Por fim o cDNA
dupla-fita (dscDNA) foi purificado por fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (item
3.7.3) e em colunas Microcon YM-100 Centrifugal Filter Unit (Millipore – item
3.7.1). O dscDNA purificado utilizado para reação de trancrição in vitro com
RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems (Promega). Na reação
foram adicionados 1X tampão, 7,5 µM de cada rNTP (rATP, rCTP,rGTP e rUTP) e 2,5 µl Enzyme T7 Mix (Invitrogen) em volume final de 25,0µl. A reação foi incubada a 37°C por 6 horas. O RNA amplificado foi purificado com
utilização do reagente TRIzol® Reagent (Sigma – Aldrich Corporation),
segundo as recomendações do fabricante. Para síntese de primeira fita do cDNA, o RNA amplificado (6 µl) foi incubado com 1 µg de oligonucleotídeo TS
(5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG3’) por 10 minutos a 700C.
Foram adicionados 1X de tampão; 0,01 M DTT; 1 mM dNTP; 40 unidades de
RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega); 400 unidades da enzima
SuperscriptII (Life Technologies) e 0,5 µg de oligonucleotídeo dT(24) em
volume final de 20 µl. A reação foi incubada a 420C por duas horas. A síntese
da segunda fita do cDNA foi realizada com reagentes do Advantage® cDNA PCR Kit (Clontech), segundo protocolo descrito no acima. O dscDNA foi purificado por fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (item 3.7.3) e em coluna
Microcon YM-100 Centrifugal Filter Unit (Millipore – item 3.7.1).
3.5.2. Desnaturação e renaturação
Para desnaturação as moléculas de cDNA foram aquecidas a 96°C por 20 minutos. Posteriormente foram renaturadas lentamente por incubação a
42°C por 24 horas na presença de 0,2% SDS; 0,5 M NaCl; 0,05 M Tris-HCl pH 7,5 e 30% formamida em volume final de 30 µl para favorecer a formação de moléculas de heteroduplexes. Ao final da reação a amostra foi purificada pelo GFX PCR and Gel Band Purification Kit (item 3.7.1)
3.5.3. Clivagem com a enzima exonuclease VII
A enzima Exonuclease VII (USB) foi utilizada para degradação especifica de moléculas de cDNA simples-fita com extremidades livres. Cada 1 µg de amostra foi incubado com 70 mM Tris-HCI, pH 8.0; 8 mM EDTA, pH 8.0; 10 mM 2-mercaptoethanol; 50 µg/ml BSA e 0,2 unidades da enzima Exonuclease VII em volume final de 50 µl. A reação foi incubada a 37°C por 30 minutos e posteriormente a 95°C por 10 minutos para inativação da enzima. A purificação foi feita pelo método de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (item 3.7.3).
3.5.4. Digestão com a enzima de restrição DpnII
A enzima DpnII (New England Biolabs) reconhece o seguinte sítio de restrição:
Por ser constituído por 4 nucleotídeos é esperado que este sítio seja encontrado a cada 256pb na molécula de DNA.
Na reação foram utilizadas 10 unidades da enzima na presença de 1X tampão em volume final de 15 µl. A reação foi incubada a 37ºC por 3 horas, sendo que após 1 hora foi adicionado mais 5 unidades da enzima. A amostra foi purificada pelo método de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (item 3.7.3). Como controle positivo da reação de clivagem foi utilizado um fragmento de 459pb que contém um único sítio de reconhecimento da enzima, gerando dois fragmenteos menores de 127 e 332pb.
3.5.5. Recuperação das estruturas de heteroduplex por purificação biotina-estreptavidina
3.5.5.1. Ligação ao oligonucleotídeo 25-mer randômico biotinilado
Para recuperação das estruturas de heteroduplex foi utilizado um oligonucleotídeo formado por 25 nucleotídeos combinados randomicamente o
qual possui uma molécula de biotina na extremidade 5’. Cem picomoles deste
oligo foram incubados com a amostra de cDNA na presença de 6X SSC e 0,1% SDS a 65 ºC por 16 horas.
3.5.5.2. Preparo das partículas magnéticas
Para cada amostra foram utilizadas duas alíquotas de 1 mg de partículas magnéticas com estreptavidina (Roche). Cada alíquota foi lavada
com 300 μl de tampão de ligação TEN100 (10 mM Tris-HCl; 1mM EDTA;
100 mM NaCl, pH 7.5) três vezes. As partículas magnéticas foram matidas no tampão de ligação TEN100 até o momento de uso.
3.5.5.3. Purificação biotina-estreptavidina
A solução de 100 μl de cDNA e oligonucleotídeo biotinilado foi
adicionada a uma alíquota de partículas magnéticas com estreptavidina (1 mg) e incubada por 30 minutos a temperatura ambiente em rotação, permitindo a ligação entre a biotina e a estreptavidina. Em seguida, a amostra foi colocada no separador de partículas magnéticas e a solução líquida foi removida e adicionada à segunda alíquota de partículas magnéticas (1 mg) para aumentar a porcentagem de recuperação das estruturas de heteroduplex. Esta segunda alíquota foi igualmente incubada por 30 minutos a temperatura ambiente em rotação, e, em seguida, a amostra foi colocada no separador de partículas magnéticas e a solução líquida descartada. A
primeira e a segunda alíquota de partículas foram misturadas em 200 μl de
tampão de lavagem TEN1000 (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; 1 M NaCl, pH 7,5). A solução final foi colocada no separador de partículas magnéticas e a solução líquida descartada. Foram realizados mais dois ciclos de lavagem com o tampão TEN1000. Para eluição foi adicionada uma solução desnaturante de 6 M Guanidina-HCl para desfazer a ligação entre biotina e estreptavidina. Após 40 minutos de incubação em rotação a solução foi colocada no separador de partículas magnéticas e a solução líquida foi removida e reservada. Após a eluição a amostra foi purificada pelo método de fenol:clorofórmio:álcool Isoamílico (item 3.7.3).
3.5.6. Ligação aos adaptadores
Os adaptadores XDPN são oligonucleotídeos sintetizados
comercialmente desenhados especificamente para conter região de complementariedade do sítio GATC coesivo gerado após clivagem com a enzima DpnII. A sequência e a estrutura dos oligonucleotídeos estão descritas abaixo:
XDPN12: 5’GATCTCTCGAGT3’
XDPN14: 5’CTGATCACTCGAGA3’
5’ CTGATCACTCGAGAGATC...GATCTCTCGAGT 3’
3’ TGAGCTCTCTAG…..…...…...CTAGAGAGCTCACTAGTC 5’
Inicialmente foram adicionados ao dscDNA 1X tampão, 400 pmol do oligonucleotídeo XDPN12 e 400 pmol do oligonucleotídeo XDPN14. Esta solução foi incubada a 55ºC por 1 minuto. Em seguida houve uma diminuição de 2ºC de temperatura a cada 2 minutos, de 54°C até 28ºC. A temperatura foi diminuída de 28°C a 14ºC por redução de 2ºC de temperatura a cada 4 minutos. Estas condições favorecem um anelamento mais acurado dos oligonucleotídeos as sequências complementares. Só então foram adicionadas 2000 unidades da enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen) e a reação
Fragmento de cDNA clivado por DpnII
foi incubada a 14ºC por 16 horas. Por fim, o produto foi purificado em colunas
Microcon YM-100 Centrifugal Filter Unit (Millipore – item 3.7.1).
3.5.7. Reação em cadeia da polimerase
O volume total da reação de RT-PCR foi de 20 µl, contendo 1X
tampão; 0,1 mM de dNTP; 1,5 mM de MgCl2; 200 pmoles de oligonucleotídeo
XDPN18 (5’CTGATCACTCGAGAGATC3’); 2 unidades da enzima de
GoTaq® DNA Polymerase (Promega) e 10 µl do cDNA purificado (10% do
volume total). O oligonucleotídeo XDPN18 possui complementariedade com a sequência do oligonucleotídeo XDPN14 e o sítio GATC, conforme esquema abaixo. O programa da reação seguiu as seguintes etapas: 4 minutos a 95ºC, seguidos de 40 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 1 minuto a 58ºC e 4 minutos a 72ºC, seguido de 6 minutos a 72ºC.
XDPN18: 5’CTGATCACTCGAGAGATC3’
5’ CTGATCACTCGAGAGATC...GATCTCTCGAGT 3’
3’ CTAGAGAGCTCACTAGTC 5’
5’ CTGATCACTCGAGAGATC 3’
3’ TGAGCTCTCTAG……...…….... CTAGAGAGCTCACTAGTC 5’
3.5.8. Clonagem
3.5.8.1. Ligação ao vetor
A reação de ligação ao vetor de clonagem foi feita com o InsT/Aclone PCR Product Cloning Kit (Fermentas) em volume final de 10 µl, contendo 1X tampão; 0,055 µg do plasmídeo pTZ57R/T; 1 µl PEG 4000; 1,75 unidades T4 DNA ligase e 6,65µl do produto de PCR. A reação foi incubada a 22°C por 16
horas. Por fim, a ligação foi dialisada por 20 minutos em membrana de nitrocelulose de 0,025 µm (Millipore).
3.5.8.2. Transformação
A transformação foi realizada por eletroporação (2,5 KV, 25 μFD, 200
OHMS) de bactérias E. coli DH10B com 3 μl da ligação. Os transformantes
foram cultivados a 37°C sob agitação de 200 rpm por 40 minutos, e logo em seguida, foram plaqueadas em meio CG (Invitrogen) contendo o antibiótico ampicilina (100 mg/ml) e mantidas por 16 horas a 37ºC para crescimento de colônias individuais.
3.5.8.3. PCR de colônia
A reação de PCR de colônia foi realizada em volume final de 20 µl, contendo 1X tampão; 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP; 2 pmoles do oligonucleotídeo M13F (5’GTAAAACGACGGCCAG3’); 2 pmoles do oligonucleotídeo M13R (5’CAGGAAACAGCTATGAC3’) e 0,5 unidade da enzima Taq Polimerase Phoneutra. A reação foi incubada a 95°C por 4 minutos, seguidos de 35 ciclos de 95°C por 45 segundos, 60°C por 1 minuto e 72°C por 4 minutos, e por fim, 72°C por 7 minutos.
3.5.9. Sequênciamento da biblioteca
O sequênciamento dos fragmentos das bibliotecas de cDNA enriquecidas para splicing alternativo foi realizado pelo método Sanger no aparelho ABI Prism 3130 (Applied Biosystems). A reação foi realizada com
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems), segundo
as especificações do fabricante.
Para facilitar a identificação das sequências foi estabelecida uma nomenclatura que contém: 3 letras iniciais que identifiquem o tecido da
biblioteca (BES – breast); dois números que indicam a biblioteca (01; 02; em sequência); três números que identificam a placa de sequênciamento (001; 002;...); uma letra e dois números que identificam a posição na placa de sequênciamento (A01; A02; B01...).
3.6. Construção da biblioteca de cDNA para análise de transcriptoma