Mönü Planlamasının Evreleri

Alterações na regulação de splicing vêm sendo correlacionadas com 15% a 50% das doenças hereditárias humanas (KRAWCZAK; REISS; COOPER, 1992), incluindo Parkinson (HYMAN et al., 2005; JIANG et al., 2000), Alzeimer (HEINZEN et al., 2007), neurofibromas (BOTTILLO et al., 2007) e câncer (SREBROW; KORNBLIHTT, 2006). Estas alterações podem ocorrer por mutações nos elementos em cis como mutações nos sítios doador e aceptor de splice ou nas sequências ativadoras e/ou silenciadoras. Como exemplo, mais de 60% das sequências reguladoras de splicing do gene BRCA1, o qual está associado ao câncer de mama hereditário, são afetadas por mutações (PETTIGREW et al, 2005).

Usualmente as mutações pontuais detectadas no DNA genômico são classificadas em sinônimas, não-sinônimas ou non-sense, sem considerar as mutações em sítios de splice. No entanto, estimativas sugerem que 60% das mutações que causam doenças levam a defeitos no splicing ao invés de alterações na sequência de aminoácidos (LÓPEZ-BIGAS et al, 2005). Mutações sinônimas, isto é, sem alteração na sequência de aminoácidos, e mutações encontradas nos íntrons podem ser erroneamente consideradas como mutações neutras em câncer, uma vez que podem causar alterações importantes nos sítios reguladores de splicing, resultando na alteração da proteína. Há também o caso de mutações assumidas como a causa de doenças devido à alteração na sequência de aminoácido, que, após análises mais detalhadas e estudos funcionais, são reveladas como mutações que alteram o splicing, causando danos ainda maiores, como a perda de éxons inteiros que podem alterar substancialmente a estrutura da proteína, do que a

simples troca de um aminoácido (BLENCOWE, 2006; LÜTZEN et al., 2008). Portanto, analisar as regiões intrônicas e não codificantes podem ser extremamente importantes para caracterizar o perfil de mutações que levam a alterações no padrão de splicing e consequentemente nos transcritos de um gene em uma determinada doença.

A desregulação no padrão de variantes de splicing pode também decorrer de alterações nas proteínas reguladoras trans devido à ativação ou à repressão de vias de sinalização celular que interfiram com o nível de expressão desses genes, ou ainda por mutações ou variantes de splicing nesses genes. Alterações no nível de expressão dos fatores de splicing podem estar relacionadas ao aparecimento de variantes aberrantes, ou ainda causar um desbalanço entre duas ou mais variantes expressas em uma determinada célula, acarretando o aparecimento de doenças (BRINKMAN, 2004; PIND; WATSON, 2003; STIECKLER et al., 1999). Análises bioinformáticas sugerem que cerca de 80% dos fatores de splicing se encontram mais expressos nos tumores quando comparado ao tecido normal (KIRSCHBAUM-SLAGER et al., 2004).

Alterações no padrão de splicing em genes envolvidos com processos celulares importantes, como adesão, proliferação, morte celular, diferenciação, motilidade e invasão têm sido frequentemente encontradas devido à mutações na sequência de nucleotídeos dos elementos cis e alterações nas proteínas reguladoras, e podem contribuir para o aparecimento ou progressão tumoral (KALNINA et al., 2005) (Figura 10).

Figura 10: Alterações no padrão de splicing alternativo e sua implicância com o

câncer. Modificado de Srebrow e Kornblihtt (2006).

Diferentes variantes de splicing do gene CD44, envolvidos com adesão celular, foram associadas à progressão (PIND; WATSON, 2003) e metástase (NAOR et al., 2002) em câncer de mama. O gene p53, um importante regulador do ciclo celular, possui mais de 9 variantes descritas, e a maioria resulta em uma proteína truncada não funcional (KHOURY;BOURDON, 2010). Em relação a influência da expressão de variantes de splicing específicas com o controle de proliferação e morte celular, podemos citar os genes BCLX (MERCATANTE et al., 2001) e FAS (IZQUIERDO et al., 2005). O gene BCLX possui duas variantes de splicing que codificam isoformas diferentes. A isoforma XS ou curta é pró-apoptótica enquanto a variante longa ou XL é anti-apoptótica (MERCATANTE et al., 2001). De forma similar, a variante de splicing do gene FAS com inclusão do éxon 6 codifica uma isoforma proteica que atua de forma pró-apoptótica enquanto a variante que não possui este éxon codifica uma isoforma que atua de forma antiapoptótica (IZQUIERDO et al., 2005).

1.4.1. Variantes de splicing como marcadores moleculares

Diversas variantes de splicing associadas a tumores humanos já foram descritas e podem contribuir para uma melhor compreensão do aparecimento

e desenvolvimento desses tumores. Variantes de splicing exclusiva ou preferencialmente expressas em tumores poderiam auxiliar na classificação da doença, ser indicativos da evolução ou ainda ser preditivos da resposta a determinado tratamento.

Em relação a marcador prognóstico de invasão a variante c do gene osteopontina mostrou ser especificamente expressa em carcinoma ductal invasivo quando comparado com tecido normal de mama. Além disso, foi verificada uma associação positiva entre o nível de expressão da variante e o grau do tumor (MIRZA et al., 2008). Outro exemplo interessante em câncer de mama é a presença de alta expressão de isoformas proteicas geradas por duas variantes de splicing específicas do gene VEGF ou vascular endotelial

growth factor associadas com menor sobrevida global nas pacientes

(KONECNY et al., 2004). Este gene apresenta 9 variantes de splicing descritas. As variantes estudadas neste trabalho apresentam exclusão do éxon 6, que codifica a isoforma VEGF-165 e exclusão concomitante dos éxons 6 e 7, que codifica a isoforma VEGF-121, que resultam em menor interação das isoformas proteicas com a matriz celular aumentando sua permeabilidade tecidual, promovendo angiogênese e maior agressividade a uma classe de tumores de mama. Por fim, com base nesses resultados é sugerido o uso combinado de inibidores de VEGF no tratamento desses subtipos tumorais (KONECNY et al., 2004). Nesse caso, as isoformas proteicas de VEGF-165 e -121 são marcadores de agressividade e também indicadores de tratamento.

De forma similar, a variante 1 do gene Kruppel-like 6 (KLF6) está associada a mau prognóstico em câncer de próstata, pulmão e ovário e a inibição da expressão dessa variante foi acompanhada por aumento de apoptose e regressão tumoral, sendo indicada como alvo terapêutico. Esta variante é oncogênica e de ação antagônica ao transcrito full-length considerado um gene supressor de tumor (DIFEO; NARLA; MARTIGNETTI, 2009).

1.4.2. Variantes de splicing como alvo terapêutico

A utilização de variantes de splicing para o desenvolvimento de alvos terapêuticos é altamente promissora, uma vez que tratamentos moleculares desenvolvidos para atingir especificamente uma variante de splicing oncogênica, ao invés de silenciar a ação do gene como um todo, poderia resultar em um tratamento mais eficaz com menores efeitos colaterais adversos. Apesar de poucos eventos de splicing terem sido testados clinicamente como alvo terapêutico, é esperado um maior desenvolvimento de terapias gênicas focadas no processamento de RNA, em decorrência do aumento do conhecimento dos mecanismos funcionais dos RNAs de interferência e micro RNAs (PAJARES et al, 2007).

Uma estratégia interessante é a utilização de oligonucleotídeos sintéticos antissenso. Seu modo de ação é através da ligação do oligonucleotídeo ao RNA que pode levar à degradação do RNAm pela ação da enzima RNaseH (específica para moléculas de RNA hibridas), e impedir o reconhecimento do RNAm pelo ribossomo afetando a síntese proteica ou ainda afetar o splicing do pré-RNAm (LAUFER; RESTLE, 2008). No caso específico da modulação o mecanismo de splicing e a utilização dos oligonucleotídeos podem restaurar a função do gene pela reprogramação do

splicing, ou inibir a expressão de uma variante pela interrupção do splicing

(DU; GATTI, 2009). De forma detalhada, a ligação de oligonucleotídeos sintéticos a sítios de splice específicos na molécula de pré-RNAm pode dificultar o reconhecimento desses sítios e, assim, diminuir a geração da variante oncogênica sem interferir na geração da proteína normal (Figura 11A), como também agir na molécula de RNA mensageiro processada específica da variante oncogênica impedindo a síntese proteica ou promovendo sua degradação (Figura 11B) (PAJARES et al, 2007).

Por fim, a ação de variantes oncogênicas também pode ser bloqueada pela utilização de anticorpos monoclonais direcionados contra epítopos específicos da variante oncogênica (Figura 11C) (PAJARES et al, 2007).

Figura 11: A utilização de variantes de splicing como alvo terapêutico. A – Oligonucleotídeos síntéticos podem ser usados para bloquear o reconhecimento de

éxons específicos pela maquinaria de splicing, impedindo a produção de transcritos oncogênicos. B – Oligonucleotídeos sintéticos que reconhecem variantes de splicing oncogênicas podem bloquear a síntese proteica ou sinalizar para degradação do transcrito específico. C – O uso de anticorpos contra variantes oncogênicas podem bloquear especificamente a ação destas isoformas. Modificado de Pajares e colaboradores (2007).

Apesar de promissoras, as terapias baseadas na utilização de oligonucleotídeos precisam superar diversos obstáculos para possibilitar aplicação na clínica. Para que o oligonucleotídeo seja corretamente entregue à célula alvo é necessário evitar a degradação durante a circulação no sangue, conseguir atravessar a membrana celular lipoproteica e escapar das vesículas endossomais, sem causar toxicidade celular, mantendo alta eficiência e especificidade no direcionamento (DU; GATTI, 2009; LAUFER; RESTLE, 2008).