Makro Yapı

A transição de H. capsulatum de micélio para levedura, induzida pela temperatura, tem sido considerada requisito inicial para a patogênese (Medoff, Sacco et al., 1986; Holbrook e Rappleye, 2008). Recentemente, abordagens genéticas começaram a revelar o processo regulatório que controla a conversão de Histoplasma para a fase leveduriforme e a expressão dos genes envolvidos na patogênese (Holbrook e Rappleye, 2008).

Estudo conduzido por Nemecek, Wüthrich et al. (2006) com o fungo dimórfico Blastomyces dermatitidis, descobriu uma histidina quinase que foi necessária para a expressão dos genes da fase leveduriforme de B. dermatitidis a 37 °C. Esta quinase responsável pela regulação do dimorfismo foi denominada DRK1. Em fungos dimórficos, DRK1 promove a conversão para a fase leveduriforme em resposta à mudanças de temperatura.

Além disso, cepas de H. capsulatum de baixa virulência exigem um tempo maior para a transição micélio-levedura a 37 °C, enquanto as cepas mais virulentas, que são capazes de resistir a mudanças drásticas de temperatura, convertem mais rapidamente à fase leveduriforme (Medoff, Maresca et al., 1986).

Até o momento, poucos fatores de virulência de Histoplasma foram identificados. Entre eles destacam-se os mecanismos para aquisição de ferro; uma pequena proteína secretada que é capaz de se ligar ao Ca++ em baixas concentrações (Cbp1); a melanina; uma proteína de choque térmico (HSP60); uma proteína extracelular específica da fase leveduriforme (YPS3); e um polissacarídeo da parede celular, α-(1-3)-glucano. Os três últimos fatores são localizados na superfície das cepas de H. capsulatum (Weaver, Sheehan et al., 1996; Rappleye, Engle et al., 2004; Bohse e Woods, 2007a) e estão associados ao mecanismo de adesão às células hospedeiras.

A superfície celular das leveduras constitui o primeiro contato entre o parasita e os macrófagos do hospedeiro. No entanto, no processo de fagocitose, este fungo é capaz de inibir a ativação dos mecanismos de defesa dos macrófagos. Para realizar essas tarefas, as leveduras de Histoplasma exibem moléculas na superfície celular destinadas especificamente para permitir a entrada e sobrevivência dentro dos fagócitos (Holbrook e Rappleye, 2008).

HSP60 normalmente é encontrada no citosol celular e é classificada como membro da família das proteínas de choque térmico, auxiliando no dobramento e montagem correta de proteínas e complexos protéicos (Holbrook e Rappleye, 2008). É caracterizada como uma adesina de Histoplasma que interage com moléculas do receptor complemento, CR3, nos fagócitos do hospedeiro. Segundo Bullock e Wright (1987), este receptor, entre outros como CR1 E CR4, parecem ser a principal fonte de adesão entre Histoplasma e macrófago. Estudo realizado por Habich, Kempe et al. (2006) utilizando leveduras de Histoplasma aderidas às células de ovário de hamster chinês, demonstrou que a ligação entre CR3 e HSP60 é altamente específica.

O gene YPS3 de H. capsulatum foi descrito pela primeira vez por Keath, Painter et al. (1989) e foi identificado como um dos cinco únicos genes transcritos da fase leveduriforme. Ele codifica uma proteína de 20kda específica da levedura, que pode ser encontrada tanto na parede celular, como pode ser secretada. Além disso, a expressão de YPS3 varia entre cepas de Histoplasma que diferem quanto à termotolerância e a virulência. A transcrição de YPS3 se inicia 3 dias após uma mudança de temperatura, porém a expressão torna-se indetectável depois de aproximadamente 12 dias (Bohse e Woods, 2005). Através de uma análise de Restriction fragment length polymorphism (RFLP) do gene YPS3 foi possível estabelecer que os isolados de H. capsulatum var. capsulatum que causaram a doença nos pacientes do México e América Latina apresentavam perfis genéticos distintos daqueles dos Estados Unidos (Gutierrez, Canton et al., 2008).

Neste sentido, através de sequenciamento de genes, H. capsulatum foi classificado em seis grupos filogenéticos, que estão relacionados com regiões geográficas específicas, sendo: América do Norte 1 (NAm 1), América do Norte 2 (NAm 2), Panama (Pan). América Latina A (LAm a), América Latina B (LAm B) e África (Kasuga, Taylor et al., 1999; Kasuga, White et al., 2003).

Uma segunda classificação categoriza as cepas de H. capsulatum em dois grupos, ou quimiotipos, de acordo com a presença do polissacarídeo α-(1,3)-glucano na parede celular da levedura. A parede celular das cepas do quimiotipo II contém α-(1,3)-glucano, e esse grupo

inclui a grande maioria das cepas de Histoplasma (cinco dos seis grupos filogenéticos) (Kanetsuna e Carbonell, 1971; Edwards, Alore et al., 2011). Foram identificados três genes que contribuem para a síntese de α-(1,3)-glucano nas leveduras do quimiotipo II, que têm se mostrado necessário para a virulência completa. A deleção do gene de síntese deste polissacarídeo (AGS1) resulta em leveduras sem α-(1,3)-glucano na parede celular, assim como a mutação de AMY1, que codifica uma proteína homóloga a α-(1,4)-amilase, e UGP1, que codifica a UTP-glicose-1-fosfato uridiltransferase, também desencadeiam a ausência do polissacarídeo. A perda da função desses genes atenua a virulência em macrófagos em cultura e em modelo de camundongos (Rappleye, Engle et al., 2004; Marion, Rappleye et al., 2006). Dessa forma, a ausência de α-(1,3)-glucano na parede celular de cepas avirulentas é comprovada (Klimpel e Goldman, 1988; Rappleye, Eissenberg et al., 2007).

Outro fator que contribui para a virulência de fungos dimórficos, entre eles H. capsulatum, é a melanina, um pigmento capaz de reduzir a sensibilidade dos fungos aos mecanismos de defesa do hospedeiro e gerar resistência às drogas antifúngicas, tais como anfotericina B e caspofungina. Este fenômeno de resistência ocorre, uma vez que as drogas se ligam à melanina, reduzindo a ação dos antifúngicos (Taborda, Da Silva et al., 2008).

Além dos fatores de virulência já descritos, os microrganismos podem formar biofilmes. Estas estruturas são cruciais no desenvolvimento de infecções, uma vez que servem de nicho aos agentes patogênicos e estão associados a altos níveis de resistência a agentes antimicrobianos (Kuhn, Chandra et al., 2002).

1.9. Biofilmes

Biofilmes são comunidades dinâmicas de microrganismos aderidos fortemente a superfícies biológicas e não-biológicas. A formação do biofilme representa a forma mais comum de crescimento dos microrganismos na natureza, um estado que permite que as células microbianas possam sobreviver em ambientes hostis e dispersar para colonização de outros nichos (Chandra, Kuhn et al., 2001).

A formação de biofilme é caracterizada por uma malha fibrilar de polissacárides (matriz) a qual se prendem microrganismos, formando uma arquitetura tridimensional complexa (Man, Degremont et al., 1998; Cappelli, Ballestri et al., 2000; Chandra, Kuhn et al., 2001), e, estas células microbianas, ditas sésseis diferem profundamente em suas propriedades biológicas de suas homólogas livres, flutuantes ou planctônicas (Costerton, Lewandowski et al., 1995; Donlan e Costerton, 2002). Além disso, há relatos de que os microrganismos presentes no biofilme

liberam compostos, tais como endotoxinas, DNAs, muramilpeptídeos e polissacárides, com peso molecular variando de 0,5 a 200 kDa. (Lonnemann, 2000; Cappelli, Ricardi et al., 2007; Pierce, Uppuluri et al., 2008).

Uma grande variedade de microrganismos pode ser encontrada no biofilme tais como bactérias (inclusive micobactérias), fungos leveduriformes e algas (Costerton, Lewandowski et al., 1995; Man, Degremont et al., 1998; Jabra-Rizk, Falkler et al., 2004; Ramage, Saville et al., 2005). Diversos estudos têm reportado a participação de algumas leveduras (Candida albicans e Cryptococcus neoformans) e fungos filamentosos (Aspergillus fumigatus) em infecções associadas à formação de biofilme (Ramage, Mowat et al., 2009).

A matriz de um biofilme funciona como barreira física afetando a penetração de um agente antimicrobiano aplicado externamente, protegendo as células internas no biofilme. Além disso, as células dentro de um biofilme estão sujeitas a diversos gradientes de nutriente, que geralmente resultam em células metabolicamente ativas, as quais têm acesso ao líquido adjacente na periferia do biofilme e, metabolicamente inativas, no interior (Parsek e Fuqua, 2004).

Uma definição mais complexa de biofilme, portanto, deve ser levada em consideração, isto é, além das células estarem irreversivelmente anexadas a uma superfície ou interface, embutidas em uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares produzida pelas mesmas, deve-se incluir veículos biológicos ou abióticos, e também novas características fisiológicas desses organismos, incluindo-se alteração da taxa de crescimento e o fato de organismos do biofilme transcreverem genes não expressos nos organismos planctônicos. Nesse contexto, pode- se considerar que microrganismos contidos em fragmentos que possam ter-se quebrado de um biofilme aderido a um dispositivo médico colonizado, podem circular nos fluidos corporais, sendo que esses microrganismos preservam todas as características de resistência adquiridas dos pais na comunidade microbiana (Donlan e Costerton, 2002). Depois que um biofilme é formado e a matriz de exopolissacárides é secretada pelas células sésseis, a estrutura resultante é altamente viscoelástica e se comporta de maneira semelhante a uma borracha (Stoodley, Lewandowski et al., 1998).

Durante a formação inicial do biofilme, células individuais aderem a uma superfície. A fase intermediária é caracterizada por propagação clonal, aderência contínua, produção da matriz extracelular, composta por polissacarídeos da parede celular e proteínas, e maturação da estrutura. Finalmente, a população do biofilme se dispersa em pequenos agregados ou, eventualmente, células individuais habitam sítios anteriormente não-colonizados e reiniciam o

ciclo de vida do biofilme (Costerton, Lewandowski et al., 1995; Costerton, Stewart et al., 1999; Baillie e Douglas, 2000; Stoodley, Sauer et al., 2002). A figura 2 ilustra os estágios de desenvolvimento do biofilme. A maturação do biofilme é um processo de desenvolvimento complexo que envolve alguns estágios, cada um com características únicas que devem ser consideradas para a terapêutica do biofilme com antibióticos. Na figura, cada estágio de desenvolvimento é comparado com uma imagem microscópica correspondente do desenvolvimento de biofilme por Pseudomonas aeruginosa (Davies, 2003).

Figura 2. Representação esquemática das etapas de desenvolvimento de um biofilme (Davies, 2003). A maturação do biofilme é um processo complexo que envolve vários estágios, entre eles: aderência inicial de células isoladas; propagação clonal e aderência contínua; produção de matriz extracelular; dispersão de aglomerados de células para novos nichos.

Para a compreensão de biofilmes os métodos para análise e caracterização têm evoluído, embora dependam quase que exclusivamente da microscopia eletrônica de varredura (MEV). Esta técnica utiliza soluções de álcool, acetona e xileno para desidratar gradualmente o modelo previamente à análise, uma vez que água de hidratação não é compatível com o vácuo utilizado com o feixe de elétrons. A ausência do processo de desidratação resulta em significativa distorção e artefatos da amostra; uma vez que as substâncias poliméricas extracelulares, que correspondem a aproximadamente 95% de água, serão apresentadas mais como fibras do que como uma espessa matriz gelatinosa que rodeia as células (Characklis e Marshall, 1990). Devido à sua excelente propriedade de resolução, a MEV, apesar de suas limitações, continua a ser uma importante ferramenta para análise de biofilme.

O microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) foi desenvolvido na década de 80 e possibilitou a análise de biofilmes in situ sem as limitações encontradas com o microscópio eletrônico de varredura. Esta técnica exige que os organismos presentes no biofilme sejam marcados com corantes fluorescentes. Utilizando um conjunto de marcadores, é possível quantificar todas as células e determinar quais são viáveis no biofilme. O fluorocromo FUN-1 [2-cloro-4-(2,3-(dihidro-3-metil) benzo-1,3-tiazol-2 metilideno)-1-fenilquinolinio iodedo] entra nas células por difusão passiva e, nas células viáveis e metabolicamente ativas é concentrado nos vacúolos gerando estruturas cilíndricas e intravacuolares, que são convertidas em uma sonda fluorescente vermelha (Millard, Roth et al., 1997).

Outro marcador utilizado é a Concanavalina A ou ConA, que se liga à glicose e manose da parede celular e emite uma fluorescência verde. Os dois corantes descritos anteriormente têm sido utilizados em associação para visualização de biofilmes por microscopia confocal a laser (Chandra, Kuhn et al., 2001).

Além disso, os métodos colorimétricos também podem ser utilizados na avaliação da viabilidade celular. Neste contexto, o uso de sais de tetrazólio (hidróxido de tetrazólio – XTT – 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfenyl)-5-[(Phenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium-hydroxide) representam uma das metodologias mais difundidas. Os sais de tetrazólio são compostos orgânicos heterocíclicos que substituem o aceptor normal de elétrons (O2) nos processos biológicos de redução. Estes sais são reduzidos à derivados de formazana através da aceitação de elétrons por ação enzimática (de substâncias do sistema de transporte de hidrogênio), ou por ação química (de transportadores de elétrons artificiais). O transportador de elétrons mais comumente utilizado é a menadiona, que tem como função promover a reação entre as células e o sal utilizado (Hawser, Norris et al., 1998). O sal de tetrazólio, de cor amarela, penetra rapidamente nas células intactas e, através da atividade do succinato desidrogenase mitocondrial é convertido a cristal de formazana de cor púrpura, que é quantificado fotometricamente e relacionado com o número de células viáveis (Hawser, 1996; Ramage, Vande Walle et al., 2001). O ensaio de XTT permite a obtenção dos resultados em aproximadamente três horas e tem sido útil no estudo de biofilmes, uma vez que possibilita a análise de viabilidade celular, sem que para tal seja necessário haver destruição da sua estrutura (De Logu, Saddi et al., 2005; Krom, Cohen et al., 2007).

Através deste estudo foi possível evidenciar a formação de biofilme in vitro por leveduras de H. capsulatum, um fato inédito descrito na literatura, que irá ajudar a estabelecer potenciais alvos e novos regimes terapêuticos e de prevenção para a histoplasmose, uma vez que

as novas técnicas de ionização em espectrometria de massa têm permitido o desenvolvimento de metodologias para o estudo em nível protéico da totalidade das proteínas expressas pelo genoma de um organismo ou uma célula em condições específicas (Westermeier, Loyland et al., 2002). Neste contexto, as proteínas diferencialmente expressas pelo fungo sob condições planctônicas e em biofilme serão determinadas por abordagem proteômica.