Mühendis Adaylarının Mühendislik Mesleğine Yönelik Tutum Puanlarının

As duas proteínas obtidas, BDC e BDC-ACD foram testadas quanto a sua capacidade de inibir a agregação plaquetária induzida por colágeno.

As plaquetas são frequentemente associadas à integrina αIIbβ3, que

age como mediadora da agregação plaquetária através da interação com o motivo RGD presente em alguns componentes da MEC, como fibronectina e vitronectina (PLOW et al., 2000; LUO et al., 2007; SILVA et al., 2007). Contudo, as plaquetas também expressam em sua membrana, receptores α2β1

que promovem a agregação plaquetária através da interação com o colágeno. As desintegrinas RGD (PII-SVMP) são capazes de inibir a agregação plaquetária agindo como antagonistas para αIIbβ3. Os domínios DC das PIII-SVMPs, que

apresentam o motivo ECD no lugar do RGD, têm demonstrado, capacidade de inibir agregação plaquetária, induzida por colágeno e mediada por receptores α2β1 (USAMI et al., 1994; MOURA-DA-SILVA et al., 1999; KAMIGUTI et al.,

1996; ASSAKURA et al., 2003, SILVA et al., 2004).

As moléculas de colágeno são, em sua maioria, constituídas por três cadeias, denominadas cadeias α, arranjadas em uma tripla hélice. Cada cadeia contém repetições de uma sequência característica de aminoácidos, formadas por Gly-X-Y, onde X e Y pode ser qualquer aminoácido, mas X frequentemente é uma prolina e Y, uma hidroxiprolina (CARVALHO & RECCO-PIMENTEL, 2001). Como mencionado anteriormente, algumas subunidades α de integrina (α1, α2, α10, α11, αD, αE, αL, αM, αX), possuem o domínio α I, que antecede o

domínio β-propulsor na subunidade α. Estudos cristalográficos mostram que colágenos do tipo I e IV interagem com integrinas α2β1 (e também com α1β1)

glutâmico, arginina) presente no colágeno, que é reconhecido pelo domínio α I das subunidades α de integrinas citadas acima (KNIGHT et al., 2000; EMSLEY

et al., 2000; NYKVIST et al., 2000). Essa ligação ocorre entre o glutâmico do

motivo GFOGER do colágeno e o íon metálico divalente do sítio de adesão dependente de íon metálico (MIDAS), localizado no domínio α I das subunidades α1 ou α2 de integrinas. Controversamente, JIA e colaboradores

verificaram que células MG-63 pré-incubadas com anticorpo monoclonal anti-β1

perdem sua capacidade de ligação ao colágeno tipo I, sugerindo que a subunidade β1 estaria envolvida nesta interação (JIA et al., 2000).

Nos ensaios de inibição da agregação plaquetária realizados neste trabalho o PRP, preparado a partir de sangue humano fresco, foi incubado com as proteínas a serem testadas por 2 minutos para que as proteínas pudessem interagir com os receptores e em seguida adicionou-se colágeno para que a agregação plaquetária fosse induzida.

Nos primeiros testes realizados, observou-se a ocorrência de agregação plaquetária durante a incubação do plasma com as proteínas que estavam sendo avaliadas antes mesmo da adição de colágeno. A causa desta agregação “indevida” foi a presença de trombina, em uma quantidade relativamente alta, nas amostras testadas. A trombina presente nas amostras era proveniente das reações de clivagem realizadas para separar as proteínas de interesse da proteína de fusão (GST). Com o objetivo de retirar a trombina, as amostras foram aplicadas em uma coluna de benzamidina (GE Healthcare) que possui afinidade por trombina. Era esperado que a trombina ficasse retida na coluna e as demais proteínas passassem por ela sem que houvesse ligação. Ou, ainda, se houvesse alguma interação iônica, esperava-se que as proteínas de interesse fossem eluídas com solução de NaCl. No entanto, tanto BDC quanto BDC-ACD ficaram retidas na coluna e não foi possível recuperá-las sem a utilização de uma solução denaturante. Presume-se a ocorrência de alguma

interação não iônica entre os grupos imobilizados na resina da coluna e as proteínas de interesse.

Outra tentativa para retirar a trombina foi aplicar as amostras em uma coluna de troca catiônica, SPFF (GE Healthcare). O valor teórico de pI para a trombina é 7,0 e para BDC e BDC-ACD é em torno de 4,9. Com base nessa diferença entre os valores de pI, em pH 6,0, a trombina teria carga positiva e, portanto ficaria ligada à coluna através de interações iônicas, e as proteínas de interesse teriam carga negativa e não iriam se ligar a coluna de troca catiônica. No entanto, esta tentativa não foi eficiente para separar a trombina das amostras, o que pôde ser verificado através do próprio teste de agregação plaquetária, em que continuou ocorrendo agregação antes mesmo da adição de colágeno. O pI teórico foi calculado com o auxílio do software Compute pI/Mw disponível em http://ca.expasy.org/cgi-bin/pi_tool. Esse cálculo é baseado na somatória das cargas dos aminoácidos presentes na sequência de aminoácidos da proteína analisada, sem levar em conta seu real enovelamento, o que poderia explicar o comportamento inesperado de determinadas proteínas frente aos seus valores de pI teóricos. A influência da estrutura tridimensional incide sobre aminoácidos que isoladamente deveriam adquirir uma carga positiva ou negativa em uma determinada condição de pH, mas que, dentro da macromolécula, não estão acessíveis ou estão envolvidos em interações com outros grupos dentro da própria molécula.

Finalmente, a solução para o problema da trombina veio através de modificações, de certa forma sutis, na metodologia de purificação. As amostras com excesso de trombina estavam sendo purificadas por um procedimento que se diferencia, em alguns aspectos, da metodologia descrita no item 3.2: uma quantidade maior de resina (1,5 mL ao invés de 350 μL) era incubada com 50 mL (ao invés de 10 mL) do sobrenadante obtido após a centrifugação do lisado celular e a clivagem era feita com 15 U de trombina. O padrão das amostras

obtidas desta forma, analisadas por eletroforese, era semelhante ao das obtidas pelo procedimento atual. Contudo, a concentração dessas amostras após a clivagem era menor, de tal maneira que, amostras provenientes de três reações de clivagem eram reunidas e concentradas, com o uso de Centricon (Milipore). Esse procedimento fez com que fossem concentradas não só as proteínas de interesse mas também a trombina, que então, encontrava-se em uma concentração capaz de interferir nos ensaios de agregação plaquetária. Utilizando a metodologia atual (item 3.2), foram obtidas proteínas clivadas com uma quantidade menor de trombina e em uma concentração apreciável de BDC/BDC-ACD, sem que houvesse a necessidade de concentrar as amostras. Embora a trombina não tenha sido retirada, os ensaios não mais foram afetados por sua presença, dada a sua baixa concentração nas amostras.

A trombina afeta os ensaios de agregação plaquetária por ser um elemento essencial na formação do coágulo. O processo de coagulação é iniciado por uma cascata de sinalização envolvendo diversos fatores, existentes no plasma, onde se forma um complexo ativador da protrombina. Este complexo, juntamente com íons Ca2+ e fosfolipídios plaquetários, transformam protrombina em trombina. A trombina atua proteoliticamente sobre o fibrinogênio dando origem a monômeros de fibrina que, posteriormente, irão se polimerizar formando fibras de fibrina, que por sua vez são estabilizadas por um fator estabilizador das fibras de fibrina, o qual também é ativado pela trombina (figura 4.11). Em função da ação da trombina sobre a própria protrombina e sobre alguns fatores de coagulação responsáveis pela formação da protrombina, tem-se que, uma vez formada uma quantidade crítica de trombina, desenvolve-se um ciclo vicioso que provoca mais coagulação e formação de cada vez mais trombina (GUYTON & HALL, 2002).

FIGURA 4.11 – Diagrama esquemático da via intrínseca para o início da coagulação

sanguínea (GUYTON & HALL, 2002).

Nos ensaios de inibição da agregação plaquetária realizados nesse trabalho, foi verificado que na concentração de 1,0 μM, BDC foi capaz de inibir 34  4,2 % da agregação plaquetária e a BDC-ACD inibiu 30  4,4 %. Na concentração de 2,0 μM, os resultados foram 45  1,3% e 47  3,1% para BDC e BDC-ACD, respectivamente. Os resultados estão representados no gráfico da figura 4.12.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 10 20 30 40 50 60 Ini bi ç ã o A gr e ga ç ã o P la qu e tá ri a ( % ) Concentração (M) BDC BDC-ACD

FIGURA 4.12 – Gráfico da inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno

pelas proteínas BDC e BDC-ACD.

Os valores de inibição da agregação plaquetária obtidos para BDC e BDC-ACD, na concentração 1 μM indicam que a capacidade de inibição da proteína selvagem é um pouco maior que a da proteína mutante (inibiu 4,0 % a mais). Contrariamente, na concentração 2 μM, a proteína mutante se mostrou mais ativa que a proteína selvagem, contudo, a diferença de valor foi ainda menor (inibiu 2,0 % a mais). Portanto, de modo geral, observa-se que os valores obtidos nos testes de agregação (e considerando os erros associados a eles) são bem próximos, sugerindo que a mutação no motivo ECD do domínio tipo- desintegrina, não afetou significativamente a atividade dos domínios DC da botropasina. Portanto, nossos resultados evidenciam que o glutâmico presente no motivo ECD, não está envolvido diretamente na interação da proteína botropasina com a integrina α2β1.

A proteína em fusão GST-BDC também foi testada quanto a sua capacidade de inibir a agregação plaquetária, no entanto, diferentemente de GST-HF3-DC (MENEZES et al, 2010), não apresentou atividade. Deste modo, pressupõe-se que a GST interage com a BDC de tal maneira que esta interação esteja encobrindo regiões importantes para ligação da BDC à outras moléculas do meio.

Até o presente momento não há nenhum estudo na literatura em que tenha sido descrito a obtenção dos domínios DC de uma PIII-SVMP em que o glutâmico do motivo ECD foi substituído. MENEZEs et al. (2010) relatam terem feito mutação nos resíduo Glu e Asp do ECD da PIII-SVMP DC-HF3, porém a proteína mutada no resíduo Glu não foi obtida na forma solúvel. Isso pode ser visto como um indicativo de que o resíduo Glu do motivo ECD tem uma importância distinta em diferentes PIII-SVMPs. Contudo, seu papel não estaria relacionado com a ligação às integrinas e sim com a estabilização da estrutura da proteína. A substituição de Glu por Ala no ECD da DC-HF3 alterou a conformação de maneira drástica, tornando-a insolúvel, contudo, a mesma substituição, não alterou significativamente nem a solubilidade, nem a atividade inibitória da agregação plaquetária da botropasina-C, presumindo-se, portanto, que não houve alteração significativa de sua estrutura.

DC-HF3 mutada no resíduo Asp, por outro lado, foi obtida na forma solúvel e apresentou uma atividade significativamente menor na inibição da agregação plaquetária (MENEZES et al, 2010). Considerando que o Asp do ECD atua na ligação de um dos sítios de ligação ao Ca2+, que tem um papel importante na estabilização da proteína, é possível que a diferença observada na capacidade de inibição da agregação tenha ocorrido devido à perda parcial da conformação ativa da proteína.

Considerando que apenas os domínios DC das PIII-SVMPs, incluindo a jararagina (USAMI et a., 1994), são suficientes para inibir a agregação plaquetária, fica claro que a ligação dessas proteínas às integrinas impedem a ligação do colágeno às integrinas. Por outro lado, MOURA-DA- SILVA e colaboradores (MOURA-DA-SILVA et al, 2008) apontam um motivo sequencial da molécula como responsável pela interação da jararagina com o colágeno. Este motivo está inserido em uma região denominada subdomínio-Da da molécula, que faz parte do domínio D (tipo-desintegrina) da jararagina. Também foi sugerido que a interação com o colágeno é importante para atividade hemorrágica das PIII-SVMPs, uma vez que estas possuem essa mesma região não conservada. Além disso, estudos posteriores mostraram que estas interações com o colágeno são suficientes para inibir a agregação plaquetária (TANJONI et al, 2010). O subdomínio-Da desintegrina está representado abaixo:

GSQCGHGDCCEQCKFSKSGTECRASMSECDPAEHCTGQSSECPADVFHK

O motivo apontado como responsável pela interação com o colágeno está destacado em negrito. Observa-se que o motivo ECD está inserido dentro do motivo destacado.

Foi verificado ainda que a região da jararagina que se liga ao colágeno não é a mesma que se liga às integrinas α2β1 (TANJONI et al, 2010).

Deste modo verificamos que a inibição da agregação plaquetária por PIII- SVMPs não necessariamente ocorre devido à ligação ao receptor α2β1, podendo

ocorrer em decorrência da ligação ao colágeno. No caso de BDC e BDC-ACD, independente da ligação que esteja ocorrendo, os valores obtidos em nossos ensaios mostraram que o glutâmico do ECD não interfere na ligação e, portanto, não contribuiu para o efeito de inibição observado nas proteínas.

Se assumirmos que o motivo ECD do domínio tipo-desintegrina não está diretamente envolvido com a ligação na interação das PIII-SVMPs poderíamos então pressupor que estas interações ocorrem por meio da região HVR. No entanto, esta também seria uma conclusão precipitada. Primeiramente, temos que considerar que nem todas as PIII-SVMPs possuem uma região hiper variável (como foi mostrado no item 1.3 da introdução), em algumas PIII essa região é bem conservada. Contudo, de fato, o domínio C das PIII-SVMPs tem sido apontado como uma região importante na interação dessas proteínas com os receptores α2β1 (sendo ela correspondente a região hiper variável ou não).

Um estudo com domínios recombinantes C (rico em cisteínas) e D (desintegrina) da HF3 em fusão com GST, mostrou que o domínio C apresentou grande potencial de inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno (cerca de 88%, na concentração de 0,5 μM), em contra partida, para o domínio D a inibição máxima foi em torno de 25 % na concentração de 2 μM, evidenciando a relevância do domínio C nestas interações (MENEZES, et al 2010).

JIA et al (1997) mostraram que os domínios DC da atrolisina A recombinante (A/DC), inibem a agregação plaquetária induzida por colágeno e por ADP. Em um estudo posterior foi observado que somente o domínio C da atrolisina A também foi capaz de inibir agregação plaquetária induzida por colágeno, mas não inibiu a agregação induzida por ADP, sugerindo que a porção rica em cisteína dessa proteína tenha especificidade de ligação para o receptor α2β1 (JIA et al, 2000).

Em ensaios de inibição da adesão celular mediada por colágeno, realizado com células K562 transfectadas com subunidade α2 de integrinas, o

domínio ‘rico em cisteína’ (C) da jararagina não exibiu a capacidade de inibir a adesão das células porém, inesperadamente, um fragmento contendo somente a

região hiper variável do domínio C demonstrou ser ativo neste ensaio. Essa diferença foi considerada uma consequência do enovelamento e da extensão em que os resíduos estão expostos e disponíveis para interagir com outras moléculas (TANJONI, et al 2010).

A análise de todos os estudos citados mostra que as PIII-SVMPs possuem diferentes regiões capazes de se ligar a ligantes distintos, que a atividade dessas proteínas depende muito de sua estrutura tridimensional e sugere que a maneira pela qual a estrutura tridimensional é afetada por mudanças é variável entre as proteínas pertencentes a esta classe, sendo, portanto, difícil fazer generalizações a respeito da relação estrutura-função destas proteínas.