Listeria monocytogenes’in İzolasyon ve İdentifikasyonunda Gereçler ve Hazırlanışları

Listeria Enrichment Broth

Listeria Enrichment Broth Base (Merck-KGaA 64271 Darmstadt, Germany- 1.11951) besiyerinden 36 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda (Köttermann D-3162) eritilerek pyrex ĢiĢelere 225‟er ml dağıtıldı (Resim 2.1). Otoklavda (DH-WAC 010080-Daihan Scientific-WiseClaveTM) 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. 500 ml besiyeri için Listeria selektif zenginleĢtirme suplementinin (Merck-1.11781) bir flakonu 1 ml steril distile suda çözündürüldü.

Resim 2.1. Pyrex ġiĢelere DağıtılmıĢ Listeria Enrichment Brothlar. Oxford Agar

Oxford Listeria Selective Agar Base (Merck-1.07004) besiyerinden 58,50 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. Bir flakon selektif suplement (Merck-1.07006), 5 ml etil alkol (Merck-1.00983) - distile su karıĢımıyla sulandırıldı. 500 ml besiyerine 1 ml suplement eklendi. Aseptik koĢullar altında steril petrilere (LP Italiana SPA-9005A-AA) dökülen besiyeri, 37ºC‟de 24 saat sterilite kontrolü yapılarak, kullanılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi (Resim 2.2).

Resim 2.2. Oxford, Kanlı ve Tryptone Soya Yeast Ekstract Agar‟ın Buzdolabında Muhafazası. Tryptone Soya Yeast Ekstract Agar

Tryptone Soya Agar (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England-CM 131) besiyerinden 40 g ve yeast ekstrakttan (Merck-1.03753) 6 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize

edildi. Aseptik koĢullar altında steril petrilere dökülen besiyeri, 37º

C‟de 24 saat sterilite kontrolü yapılarak, kullanılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi. Tryptone Soya Agar

Tryptone Soya Agar (Oxoid-CM 131) besiyerinden 40 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. Aseptik koĢullar altında steril petrilere dökülen besiyeri, 37ºC‟de 24 saat sterilite kontrolü yapılarak, kullanılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi. Brain Heart Infusion Agar

Brain Heart Infusion Agar (Merck-1.13825) besiyerinden 52 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. Aseptik koĢullar altında steril petrilere dökülen besiyeri, 37ºC‟de 24 saat sterilite kontrolü yapılarak, kullanılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi.

Tryptic Soy Broth

Tryptic Soy Broth (Merck-1.05459) besiyerinden 30 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra vida kapaklı test tüplerine (Isolab 077.03.001) farklı miktarlarda (1,5-5ml) aktarıldı. Otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi.

Brain Heart Broth

Brain Heart Broth (Merck-1.10493) besiyerinden 37 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra vida kapaklı test tüplerine farklı miktarlarda (1,5-5ml) aktarıldı. Otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. Kullanılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi.

Nutrient Broth

Nutrient Broth (Merck-1.05443) besiyerinden 8 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra vida kapaklı test tüplerine 5 ml aktarıldı. Otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi.

Tryptone Soya Yatık Agar

Tryptone Soya Agar (Oxoid-CM 131) besiyerinden 40 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra vida kapaklı test tüplerine 5 ml aktarıldı. Otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. 37ºC‟de 24 saat sterilite kontrolü yapılarak, kullanılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi.

Brain Heart Infusion Yatık Agar

Brain Heart Infusion Agar (Merck-1.13825) besiyerinden 52 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra vida kapaklı test tüplerine 5 ml aktarıldı. Otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. 37ºC‟de 24 saat sterilite kontrolü yapılarak, kullanılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi.

Resim 2.3. Tryptone Soya ve Brain Heart Infusion Yatık Agarları. Brucella Broth Saklama Besiyeri

Brucella Broth (Becton Dickinson Company, Sparks MD 21152 USA-BD- 211088) besiyerinden 28 g ve agardan (Merck-1.01614) 1,6 g, 850 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra 150 g gliserin (Merck-5.00190) ilave edilerek karıĢtırıldı. Eppendorf tüplerine 5 ml aktarıldı ve otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi.

Katalaz Solüsyonu

Katalaz testinde %3‟lük H2O2 kullanıldı. 3 ml H2O2 (Merck-1.08600) üzerine

97 ml distile su ilave edildi. Oksidaz Testi

Oksidaz test çubukları (Oxoid-BR0064A) kullanıldı.

Sulfate Indole Motility Medium

Sulfate Indole Motility Medium (Merck-1.05470) besiyerinden 30 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü ve su banyosunda eritildi. Vida kapaklı test tüplerine 10‟ar ml aktarıldı ve otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi.

Kanlı agar

Blood Agar Base (Merck-1.10886) besiyerinden 40 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. Defibrine kandan besiyerine 50 ml eklendi. Aseptik koĢullar altında steril petrilere dökülen besiyeri, 37ºC‟de 24 saat sterilite kontrolü yapılarak, kullanılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi.

Nitrate Broth

Nitrate Broth (Merck-1.10204) besiyerinden 16,5 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra vida kapaklı test tüplerine 5 ml aktarıldı. Otoklavda 121º

C‟de 15 dk. sterilize edildi. Griess Ilosvay Solüsyonu (A)

Griess Ilosvay (A) solüsyonu, 1 g sülfanilik asit (Merck-1.00686), 100 ml 5N asetik asitte (Merck-1.00056) çözündürülerek hazırlandı.

Griess Ilosvay Solüsyonu (B)

Griess Ilosvay (B) solüsyonu, 1 g α-naftilamin (Merck-8.22291), 100 ml 5N asetik asitte çözündürülerek hazırlandı.

Metil Red-Voges Proskauer Broth

MR-VP Broth (Merck-1.05712) besiyerinden 17 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Su banyosunda eritildikten sonra vida kapaklı test tüplerine 5 ml aktarıldı. Otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi.

Karbonhidrat Fermentasyon Test Besiyerleri

L. monocytogenes‟in biyokimyasal identifikasyonu amacıyla dekstroz (Merck-8346), eskulin (Merck-1.00842), maltoz (Merck-1.05910), mannitol (Merck- 1.05982), ksiloz (Merck-1.08689) ve ramnoz (Merck-1.047369) karbonhidratları kullanıldı.

Buffered Peptone Water (Oxoid CM 1049) besiyerinden 20 g, 1000 ml distile suda çözündürüldü. Ġçerisine %0,01 konsantrasyonunda olacak Ģekilde fenol red (Merck-1.07241) katıldıktan sonra vida kapaklı test tüplerine 5 ml aktarılarak otoklavda 121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. Dekstroz, eskulin, maltoz, ramnoz, mannitol ve ksiloz karbonhidratlarının %5‟lik solüsyonları hazırlanarak otoklavda

121ºC‟de 15 dk. sterilize edildi. Karbonhidrat testleri aĢamasında her bir steril karbonhidrat solüsyonundan steril indikatörlü peptonlu su besiyerine %1 oranında aktarıldı.

Gram Boyama Solüsyonları Kristal Viyole Çalışma Solüsyonu

Koyu renkli muhafaza ĢiĢesine kristal viyole stok solüsyonundan (40 g kristal viyole, Merck-1.01408 + 400 ml etil alkol) 40 ml, amonyum oksalat stok solüsyonundan (16 g Amonyum oksalat, Merck-101190 + 1600 ml distile su) 160 ml karıĢtırılarak süzüldü.

Lugol Çalışma Solüsyonu

Koyu renkli muhafaza ĢiĢesine lugol stok solüsyonundan (25 g iyot kristalleri, Merck-1.04763 + 50 g potasyum iyodür, Merck-1.05051 + 500 ml distile su) 60 ml, distile sudan 220 ml ve %5‟lik sodyum bikarbonattan 60 ml eklenerek karıĢtırıldı. Safranin

0,5 g Safranin O (Merck-1.15948), 10 ml etil alkol ve 100 ml distile su ile eritildi. Bir gün bekletildi ve koyu renkli ĢiĢelere süzüldü.

2.1.2. Listeria monocytogenes İzolatlarının Moleküler İdentifikasyonunda