Lakkazların kot yıkamada kullanımı

Lakkazlar, kot yıkamada taşlama işleminde ponza taslarının yerine kullanılabilmektedir. Kot yıkamada taşlama işleminin esası, ponza tası ile istenilen

aşındırmanın sağlanması için ürünlerin yıkanmasıdır. Yıkamanın ardından ürünler, sodyum hipoklorit ile kısmen ağartılmakta, nötralize edilmekte ve tekrar yıkanmaktadır.

Bu işlemlerin tümü büyük çevresel kirliliğe yol açtığından enzim uygulamaları da yapılmaktadır. Örneğin selülazlar, lif yüzeyini aşındırıcı etkiye sahip olduklarından tas yıkama görüntüsünü elde etmek için ponza taslarının yerini kısmen alabilmektedir.

Bununla birlikte lakkazlar da indigo boyalı denim giysileri daha acık tonlara ağartabilme etkisine sahiptir (Pazarlıoğlu vd., 2005).

Lakkazlar, kot üzerindeki indigoyu renksizleştirme acısından tek baslarına yeterli olamadıkları için indigodan moleküler oksijene elektron transferi sağlayan aracılı sistemler de geliştirilmiştir. Lakkaz ve aracılı sistem, atkı ipliklerini etkilemeden yalnızca indigoyu parçaladığı için işlem sonucu gri nüanslı kot elde edilmektedir.

Kotun klasik hipoklorit ağartması ucuz, hızlı ve etkilidir. Ancak çevreye ve kota zarar vermektedir. Oysaki lakkaz ve aracılı sistem ile ağartma, ılıman koşullar altında yapılabilmekte ve çok daha kolay kontrol edilebilmektedir. Ayrıca bu sistemde ağartma etkisi fenol bileşiklerine özgü olduğundan elastikiyeti etkilememekte ve hipoklorit ağartması gibi elastomer ipliğine de zarar vermemektedir. Lakkaz aracılı sistemler, kot yıkama uygulamalarında geri boyamayı azaltmakta, aşınma seviyelerini geliştirmekte ve indigoyu ağartmaktadır (Yoon, 2005; Auterinen, 2006).

Pazarlıoğlu ve arkadaşları, lakkazların kot yıkamada kullanımına ilişkin yaptıkları çalışmada, aktifleştirilmemiş ve fenol ile aktifleştirilmiş koşullarda yetiştirilen beyaz çürükçül fungus olan Trametes versicolor’u, lakkaz (TvLac), lignin peroksidaz (LiP), manganez peroksidaz (MnP), arilalkol oksidaz (AAO) ve polifenol oksidaz (PPO) üretimi amacıyla test etmişlerdir. PPO, LiP ve AAO kültür süzüntülerinde gözlenmez iken, TvLac ve MnP aktiviteleri sırasıyla inkübasyonun dördüncü ve beşinci gününde tespit edilmiştir. Fenol ile aktifleştirilmiş kültürlerde maksimum enzim aktivitesi, kontrol kültürlerine göre yaklaşık 20 kat gelişmiştir. Optimum fenol konsantrasyonunda lakkaz üretimi; enzim aktivitesi, protein içeriği, glikoz tüketimi ve biyokütle görüntülenerek incelenmiş ve lakkaz üretiminin Trametes versicolor’un yetiştirilme koşulları ile ilişkili olmadığı belirlenmiştir. Enzimin optimum pH’ı 4,5 olarak bulunmustur. TvLac’ın kinetik sabitleri, Km değeri 0,61 mM ve Vmax 8264 U/L (R2=0,99) olarak belirlenmiştir. T.versicolor’dan izole edilen lakkaz, aracısız

olarak kot yıkama için kullanılmıştır. Çalışmada TvLac’ın, aracılı ticari lakkazdan daha verimli olduğu ve kot yıkamada kullanılabileceği belirtilmiştir (Pazarlıoğlu vd., 2005).

2.13.3. Lakkazların Kaynatma Đşleminde Kullanımı

Kaynatma işlemleri, çeşitli kimyasal maddelerle yapılmakta ve çevresel acıdan kirlilik oluşturmaktadır. Bu nedenle daha ekolojik bir proses olan enzimatik kaynatma tercih edilmektedir. Enzimatik kaynatma işlemlerinde daha çok pektinaz kullanılmakta olup ksilanaz, proteaz, lakkaz, lipaz ve selülaz gibi enzimlerle de denemeler yapılmıştır.

Ossola ve Galante, yaptıkları çalışmada, ketene enzimatik kaynatma işleminin etkilerini incelemişlerdir. Bu amaçla ham keten liflerine endüstriyel enzimler uygulanmıştır. Kaynatma sonrası, ağartma ve yaş mekanik eğirme yapılmıştır.

Eğirmeden sonra tüm ilgili iplik parametreleri ölçülmüş ve direnç, gerilme gibi parametreler değerlendirilmiştir. Verimlilik; pektinaz > ksilanaz = galaktomannaz = proteaz >lipaz > veya = lakkaz seklinde sıralanmıştır. Buna göre lakkazların kaynatma amacıyla da kullanılabileceği ancak pektinazlar kadar verimli olmadığı görülmüştür (Ossola, 2004).

2.13.4. Lakkazların Tekstil Atık Sularının Biyolojik Parcalanması ve Renksizleştirilmesinde Kullanımı

Azo, trifenil metan ve ftalosiyanin gibi farklı kromofor grupların varlığı, boyarmaddelerin yapısal çeşitliliğini sağlamaktadır. Görsel etki ve kimyasal oksijen ihtiyacı (COD) acısından yan etkilerinin yanı sıra çoğu sentetik boyarmaddeler, toksik, kanserojen ve genotoksik etkiler de göstermektedir. Mevcut atık su sistemleri ise, bu tip atıklardan yıkıma dirençli boyarmaddeleri ve diğer organik kalıntıları tamamen uzaklaştırmakta yetersiz kalmaktadırlar (Parshetti, 2007).

Boyama atık sularının arıtılması, adsorpsiyon, koagülasyon, oksidasyon, filtrasyon ve iyonlaştırıcı radyasyon gibi kimyasal ve fiziksel yöntemler gerektirmektedir. Bu yöntemlerin tümü farklı renksizleştirme yeteneğine, sermaye

maliyetine ve operasyon hızına sahiptir. Bu yöntemler arasından koagulasyon ve adsorpsiyon yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak bunlar büyük miktarlarda atığa yol açmaktadır. Bu nedenle biyolojik işlemler, düşük maliyet ve az çamur oluşturmaları nedeniyle giderek önem kazanmaktadır (Park, 2007).

Parshetti ve arkadasları, yaptıkları çalışmada Aspergillus ochraceus NCIM-1146’nın miselyumu tarafından tekstil boyarmaddesi Reactive blue-25 (0.1g/l)’in renksizleştirilmesi ve parçalanmasını incelemişlerdir. Reactive blue-25, kromofor olarak bakır ftalosiyanin (Cu PC) ve reaktif kısım olarak monoklortriazin içeren reaktif bir boyarmadde olup tekstil sanayinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Çalışmanın esas amacı, bu boyarmaddenin renksizleştirilmesini, biyolojik parçalanmasını ve parçalanma ürünlerinin tanımlanmasını incelemek ve bunun yanı sıra renksizleştirme prosesi esnasında kültür süzüntüsündeki lakkaz, trosinaz ve lignin peroksidaz gibi hücre dışı enzimleri belirlemektir. Yapılan spektrofotometrik ve görsel incelemeler, renksizleştirmenin fungal adsorpsiyonu takip eden parçalanma sayesinde olduğunu göstermiştir. Çalışmada statik koşullar ile kıyaslandığında çalkalamalı koşulların, Reactive blue-25 boyarmaddesinin tamamen ve hızlı adsorpsiyonu (7 saat) ve renksizleştirilmesinde (20 gün) daha etkili olduğu bulunmuştur. Ortamda glikozun bulunması ise, daha hızlı bir adsorpsiyon (4 saat) ve renksizleştirme (7 gün) sağlamıstır.

Renksizleştirme sonrası süzüntüde lignin peroksidaz, lakkaz ve trosinaz gibi oksidatif enzimlerin varlığı, Reactive blue-25’in ftalimid ve diiso- butil ftalat gibi iki büyük metabolite parçalanma işleminden sorumlu olduğunu göstermiştir (Parshetti, 2007).

Kunamneni ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada Myceliophthora thermophila’dan elde edilen lakkaz enzimi, epoksi grupları ile aktifleştirilmiş polimetakrilat esaslı polimerler üzerine kovalent olarak immobilize edilmiştir. Bu şekilde elde edilen enzimin yüksek bir aktivite (203 U/g) ve pH, sıcaklık ve depolama süresi karsısında iyileştirilmiş dayanıklılık gösterdiği ancak organik çözücülere karsı artan bir dayanıklılık göstermediği bulunmuştur. Ayrıca biyokatalizörün iyi operasyonel dayanıklılık gösterdiği, 17 kullanım sonrasında ilk aktivitesinin %84’unu koruduğu görülmüştür. Đmmobilize lakkaz, altı sentetik boyarmaddenin (Reactive Black 5, Acid Blue 25, Methyl Orange, Remazol Brilliant Blue B, Methyl Green ve Acid Green 27) renginin giderilmesinde uygulanmıştır. Çalışmada, bu biyokatalizorlerin yüksek

mekanik dayanıklılık ve suda şişmeme gibi özelliklerinin, tekstil sanayinde boyarmaddelerin renginin giderilmesinde uygulama acısından elverişli olduğu belirtilmiştir (Kumanneni vd, 2008).

Lakkaz enzimleri, teknolojik ve endüstriyel alanlarda çeşitli amaçlarla kullanılmaktadır. Tekstil sanayi, lakkaz enzimlerinin kullanım alanları arasında yer almaktadır. Tekstil sanayinde, tekstil atık sularındaki boyarmaddelerin renksizleştirilmesi, ağartma, kaynatma ve kot yıkama gibi işlemlerde, kimyasal işlemlere alternatif oluşturmaları ve ekolojik olmaları nedeniyle, lakkaz enzimlerinin kullanımı ilginçtir. Lakkazların bilinen redoks potansiyelleri, fenolik olmayan bileşiklerin potansiyellerinden düşük olduğundan bu enzimler, bu tur maddeleri oksitleyememektedirler. Bu nedenle elektron transfer aracıları olarak hareket edebilen küçük moleküller ile lakkaz enzimi birleştirilerek lakkaz aracılı sistemler geliştirilmiş ve böylece lakkazların, fenolik olmayan yapıları da oksitleyebilmesi sağlanmıştır.

Lakkaz aracılı sistemler, tekstil sanayinde özellikle kot üzerindeki indigoyu renksizleştirme amacıyla uygulanmakta olup bu sistemler sayesinde geri boyama azalmakta, aşınma seviyeleri gelişmekte ve indigo ağartılabilmektedir (Arık vd, 2008).

3. YÖNTEM VE GEREÇLER

3.1. Besiyeri Ortamının Hazırlanması ve Mikroorganizmaların Kültürasyonu 3.1.1. Çalışmada Kullanılan Mikroorganizmalar

Çalışmada enzim üreticisi olarak Trametes versicolor ATCC 200801 kullanılmıştır. Gedikli, 2008 tarafından yapılan yüksek lisans tez çalışmasında T.

versicolor, denenen funguslar arasında en yüksek aktivitede lakkaz üreticisi olarak bildirilmiştir (Gedikli, 2008). Bu nedenle bu çalışma kapsamında yapılacak çevresel uygulamalar için de bu organizmadan elde edilen lakkaz aktivitesi yüksek kültür süpernatantı kullanılmıştır. Çalışma süresince ve sonrasında kültürler potato dekstroz agar (PDA) besiyerinde +4 °C’de muhafaza edilmiştir.

3.1.2. Lakkaz Üretimi Đçin Kullanılan Besiyeri ve Hazırlanması

Trametes versicolor hücreleri %3 (w/v) buğday kepeği ilave edilmiş Potato Dekstroz Broth (PDB) besiyerinde 12 gün süre ile inkübe edildiğinde en yüksek lakkaz aktivite değerine ulaşıldığı bildirilmiştir (Gedikli, 2008). Bu tez çalışmasında üretim için bu koşullar kullanılmıştır.

Çalışmada kullanılan Potato Dekstroz Broth besiyeri hazır preparasyon halinde temin edilmiştir (Acumedia). Dehidre besiyeri (gr/ml); potato infusion solids 4, dekstroze 200 bileşenlerinden oluşmakta ve pH değeri 5.1’dir. Bu besiyerinden litreye 24 gr olacak şekilde tartılıp gerekli miktarda saf su içerisinde çözülmüştür. Hazırlanan 30 g/l buğday kepeği ilave edilerek besiyeri otoklavda 121 °C’de 15 dakika süreyle sterilize edilmiştir.

Yatık PDA besiyerinde 10 gün süre ile 30°C’de geliştirilmiş T. versicolor hücreleri, steril distile su içerisinde homojenize (Heidolph, SilentCrucher M) edilmiştir.

Elde edilen homojenize süspansiyon daha sonraki çalışmalarda besiyerlerini inokule etmek amacı ile kullanılmıştır. Aseptik koşular altında bu hücre süspansiyonundan 3 ml alınarak buğday kepeği ilaveli PDB besiyerine (100ml/250 ml Erlenmayer) ilave

edilmiştir. Kültürler çalkalamalı inkübatörde 150 rpm çalkalama hızında, 30°C sıcaklıkta ve 12 gün süre ile inkübasyona bırakılmıştır. Đnkübasyon süresi sonunda, filtrasyon yapılarak biyokütle ile kültür süpernatantı birbirinden ayrılmıştır. Kültür süpernatantı enzim kaynağı olarak kullanılarak, lakkaz aktivitesi ölçülmüştür.

3.1.3. Lakkaz Aktivitesinin Ölçümü

Lakkaz aktivitesi ölçümü için tepkime tüplerinde toplam hacim 5 ml olacak şekilde substrat olarak 4.9 ml ve 1 mM Guaiakol içeren 50 mM Sodyum-Asetat tamponu (pH 4.5) ve enzim kaynağı olarak 0.1 ml kültür süpernatantı kullanılmıştır. 37

°C’de 15 dakika inkübasyondan sonra 465 nm dalga boyunda spektrofotometrede (JascoV530 UV-Vis spectrophotometer) absorbans ölçülmüştür (Taşpınar ve Kolankaya, 1998).

Çalışmada, 37 ^°C, 1 dakikada, 465 nm dalga boyunda absorbansı 0.1 birim artıran enzim aktivitesi 1 Unit aktivite olarak tanımlanmıştır.

3.2. Dekolorizasyon Çalışmaları

3.2.1. Dekolorizasyon Çalışmalarında Kullanılan Boyarmaddeler

Dekolorizasyon çalışmalarında tekstil endüstrisinde sıklıkla kullanılan ve ticari preparasyonlar halinde satılan Reaktif Red 198, Rem Blue RR, Dylon Navy 17, Rem Red RR ve Rem Yellow RR boyarmaddeleri kullanılmıştır.

Kullanılacak her bir boyarmaddenin öncelikle en yüksek absorbans değerini verdiği dalga boyunu belirlemek için bir spektrum taraması yapılmıştır. Yapılan spektrum taraması çalışması sonucunda elde edilen en yüksek absorbans değerleri, bundan sonraki çalışmalarda sabit tutularak ölçümler yapılmıştır. Elde edilen bu absorbans değerlerinde, her bir boyar madde için farklı konsantrasyonlarda çözeltiler hazırlanarak standart eğriler çizilmiştir.

3.2.2. Tarama Çalışması

Reaktif red 198, Rem Blue RR, Dylon Navy 17, Rem red RR ve Rem Yellow RR boyarmaddelerinin her biri için ayrı ayrı 3.2.1.’de anlatıldığı biçimde üretilen lakkaz enzimi ile dekolorizasyon denemeleri yapılmıştır. Tarama çalışmasında her bir boya için 50 mg/l boya konsantrasyonunda, pH 5.0, sıcaklık 35 °C, 1 ml enzim kaynağı ilave edilerek toplam 10 ml hacimde çalışılmıştır. Çalışmalar birbirinden bağımsız ve en az 3 tekrarlı olarak yapılmıştır.

Tarama çalışmaları sonucunda Rem Blue RR ve Dylon Navy 17 boyar maddelerinin lakkaz aktivitesi yüksek kültür süpernatantı tarafından dekolorize edildiği, diğer denenen 3 boyarmadde de ise her hangi bir dekolorizasyonunun gerçekleşmediği görülmüştür. Bu nedenle bundan sonraki çalışmalar iki grup halinde planlanmıştır.

Birinci grup çalışmalarda, tarama çalışmasında lakkaz enzimi ile dekolorize edilebildiği görülen Rem Blue RR ve Dylon Navy 17 boyaları için ortam şartlarının optimizasyonunu yapılmıştır. Đkinci grup çalışmalarda ise lakkaz aktivitesi yüksek kültür süpernatantı ile dekolorize edilemediği görülen Reaktif red 198, Rem red RR ve Rem Yellow RR boyarmaddelerinin lakkaz aracılı sistemleri kullanılarak dekolorizasyonlarının yapılıp yapılamayacağı araştırılmıştır. Dekolorizasyonu gerçekleştirilen boyarmaddeler için optimizasyon çalışmaları yapılmıştır.

3.2.3. Lakkaz Enzimi ile Yapılan Dekolorizasyon Çalışmaları

3.2.3.1. Rem Blue RR ve Dylon Navy 17 Boyar Maddelerinin Lakkaz Enzim Aktivitesi Yüksek Kültür Süpernatantı ile Dekolorizasyonu için Optimum Koşulların Belirlenmesi

Rem Blue RR ve Dylon Navy 17 boyar maddelerinin enzimatik dekolorizasyonda optimum koşullarının belirlenmesi için; pH, başlangıç boya konsantrasyonu, enzim miktarı, inkübasyon süresi ve sıcaklık parametreleri çalışılmıştır.

Enzimatik dekolorizasyon için kullanılan enzim kaynağı, Trametes versicolor

ATCC200801’in buğday kepeği ilave edilmiş PDB besiyerinde inkübe edilerek elde edilen ve lakkaz aktivitesi yüksek olan kültür süpernatantıdır.

3.2.3.1.1. Ortam pH Değerinin Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Bu çalışmada ortam pH değerinin enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek için 3 - 3.5 – 4 – 4.5 – 5- 5.5 – 6 - 7 – 8 pH değerleri denenmiştir. pH 3-5.5 için 0.2 M asetat tamponu, pH 6-8 için 0.2 M fosfat tamponu kullanılmıştır. Çalışma tepkime tüplerinde toplam hacim 10 ml olacak şekilde belirtilen pH değerlerinde hazırlanmış 50 mg/l konsantrasyondaki boya çözeltisinden 9 ml ve 1ml 24,4 U/ml lakkaz aktivitesine sahip enzim kaynağı ilave edilerek yapılmıştır. Đnkübasyon süresi 30 dk, inkübasyon sıcaklığı ise 35 °C’ dir. Sonuçlar 604 nm (Rem Blue RR için) ve 586 nm (Dylon Navy 17 için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

3.2.3.1.2. Başlangıç Boya Konsantrasyonunun Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi Başlangıç boya konsantrasyonunun enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek amacıyla 3.2.3.1.’ de yapılan çalışmanın sonucuna göre belirlenen pH 5 de ve 5–150 mg/l arasında hazırlanan konsantrasyonlardaki boya çözeltileri ile çalışılmıştır. Çalışmada diğer koşullar; tepkime tüplerinde toplam hacim 10 ml olacak şekilde; 9 ml belirtilen konsantrasyonlarda ve pH da hazırlanmış boya çözeltisi, 1ml 24.4 U/ml enzim aktivitesine sahip lakkaz enzimi ilave edilmiştir ve inkübasyon süresi 30 dk ve sıcaklığı 35°C’de sabit tutulmuştur. Sonuçlar 604 nm (Rem Blue RR için) ve 586 nm (Dylon Navy 17 için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

3.2.3.1.3. Enzim Miktarının Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Enzim miktarının enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek amacıyla 0.5-4 ml arasında değişen miktarlarda ve 24.4 U/ml aktivitede enzim kullanılmıştır. Çalışma

koşulları pH 5, 50 mg/l başlangıç boya konsantrasyonu, inkübasyon süresi 30 dk ve inkübasyon sıcaklığı 35°C’ dir. Sonuçlar 604 nm (Rem Blue RR için) ve 586 nm (Dylon Navy 17 için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

3.2.3.1.4. Ortam Sıcaklığının Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Ortam sıcaklığının enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek için 20-45°C arası sıcaklıklar denenmiştir. Diğer çalışma koşulları pH 5, 50 mg/l boya konsantrasyonu, 1 ml 25,3 U/ml aktiviteye sahip enzim ve inkübasyon süresi 30 dk’ dır.

Sonuçlar 604 nm (Rem Blue RR için) ve 586 nm (Dylon Navy 17 için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

3.2.3.1.5. Đnkübasyon Süresinin Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Đnkübasyon süresinin enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek amacıyla 5.-15-30-45-60-120 dk ve 12 - 24 saatler denenmiştir. Daha önce belirlenen parametreler sabit tutularak denemeler yapılmıştır. Çalışma koşulları pH 5, 50 mg/l başlangıç boya konsantrasyonu, 1ml 25,3 U/ml enzim aktivitesine sahip enzim ve inkübasyon sıcaklığı 30 °C’ dir. Sonuçlar 604 nm (Rem Blue RR için) ve 586 nm (Dylon Navy 17 için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

Tüm optimizasyon çalışmaları bir birinden bağımsız ve en az 3 tekrarlı olarak yapılmıştır. Elde edilen çalışma sonuçları bu tekrarlı denemelerin ortalama değerleri olarak hesaplanmıştır.

3.2.4. Lakkaz Enzimi ile Birlikte Aracı Kullanılarak Yapılan Dekolorizasyon Çalışmaları

Çalışma kapsamında 3.2.2.’de belirtilen tarama çalışmasının sonucunda Reaktif Red 198, Rem Red RR ve Rem Yellow RR boyarmaddelerinin lakkaz enzim aktivitesi yüksek kültür süpernatantı ile dekolorizasyonunun yapılamadığı görülmüştür. Ancak, literatür bilgisine dayanarak aracılı sistem kullanılarak lakkaz enziminin substurat çeşitliliğinin artırılabileceği bilinmektedir. Bu nedenle, çalışma sürecinde lakkaz aktivitesi yüksek kültür süpernatantının tek başına dekolorize edemediği Reaktif Red 198, Rem Red RR ve Rem Yellow RR boyarmaddelerinin dekolorizasyonunda çeşitli aracılar kullanılarak, lakkaz aracı sistemlerin kullanılabilirliği incelenmiştir. Bu amaçla dimetoxyphenol (DMP), fenol, vanilin, guiacol, veratril alkol, L-tirozin reaksiyon ortamına ilave edilerek aracı olarak etkinlikleri araştırılmıştır.

Lakkaz aracılı sistemlerinin etkinliğini araştırmak üzere yapılan çalışmalarda 3.2.2.’de belirtilen koşullar sabit tutulmuştur. Tarama çalışmasında her bir boya için 50 mg/l boya konsantrasyonunda, pH 5.0, sıcaklık 35 °C, 1 ml enzim ve 1 ml aracı ilave edilerek toplam 10 ml hacimde çalışılmıştır. Çalışmalar birbirinden bağımsız ve en az 3 tekrarlı olarak yapılmıştır. Çalışma sonucunda en etkin aracı madde olarak vanilin belirlendiği için, bundan sonraki optimizasyon çalışmalarında sadece vanilin kullanılmıştır.

Çalışmada kullanılan 3 boyarmaddeden Reaktif Red 198, Rem Red RR aracı etkinliği denenen hemen hemen tüm aracı maddeler ile dekolorize edilebildiği ve ancak Rem Yellow RR, boyar maddesinin hiçbir aracı madde ilavesi ile dekolorize edilemediği görülmüştür. Bu nedenle bundan sonraki optimizasyon çalışmaları Reaktif Red 198, Rem Red RR ile yapılmıştır.

3.2.4.1. Reaktif Red 198 ve Rem Red RR Boyar Maddelerinin Lakkaz Aracılı Sistem Kullanılarak Dekolorizasyonu için Optimum Koşulların Belirlenmesi

Reaktif Red 198 ve Rem Red RR boyar maddelerinin enzimatik dekolorizasyonunun optimum koşullarının belirlenmesi için; pH, başlangıç boya konsantrasyonu, enzim miktarı, inkübasyon süresi, sıcaklık ve aracı konsantrasyonu

parametreleri çalışılmıştır. Enzimatik dekolorizasyon için kullanılan enzim kaynağı, Trametes versicolor ATCC200801’in buğday kepeği ilave edilmiş PDB besiyerinde inkübe edilerek elde edilen ve lakkaz aktivitesi yüksek olan kültür süpernatantıdır.

3.2.4.1.1. Ortam pH Değerinin Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Bu çalışmada ortam pH değerinin enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek için 3 - 3.5 – 4 – 4.5 – 5- 5.5 – 6 - 7 – 8 pH değerleri denenmiştir. pH 3-5.5 için 0.2 M asetat tamponu, pH 6-8 için 0.2 M fosfat tamponu kullanılmıştır. Çalışma tepkime tüplerinde toplam hacim 10 ml olacak şekilde belirtilen pH değerlerinde hazırlanmış 50 mg/l konsantrasyondaki boya çözeltisinden 8 ml, 1ml 24.4 U/ml enzim aktivitesine sahip enzim ve aracı olarak 1 ml vanilin ilave edilerek yapılmıştır. Đnkübasyon süresi 30 dk, inkübasyon sıcaklığı ise 35 °C’ dir. Sonuçlar 525 nm (Reaktif Red 198 için) ve 521 nm (Rem Red RR için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

3.2.4.1.2. Aracı Konsantrasyonunun Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Aracı konsantrasyonunun enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek amacıyla, daha önce belirlenen koşullar sabit tutularak, aracı konsantrasyonu 25-1000 µM arasındaki derişimler kullanılarak çalışılmıştır. Çalışma, pH 6.0, başlangıç boyar madde konsantrasyonu 10 mg/l, 1ml 25,5 U/ml enzim aktivitesine sahip lakkaz içeren kültür süpernatantı ve aracı olarak belirtilen derişimlerde hazırlanan 1 ml vanilin kullanılarak sıcaklık 30 °C’de sabit tutulmuş ve deneme 30 dakika sürdürülmüştür.

3.2.4.1.3. Başlangıç Boya Konsantrasyonunun Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi Başlangıç boya konsantrasyonunun enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek amacıyla kısım 3.2.4.1.1.’ de yapılan çalışmanın sonucuna göre belirlenen pH 5 de ve 5–150 mg/l arasında hazırlanan konsantrasyonlardaki boya çözeltileri ile

çalışılmıştır. Çalışmada diğer koşullar; tepkime tüplerinde toplam hacim 10 ml olacak şekilde; 8 ml belirtilen konsantrasyonlarda ve pH da hazırlanmış boya çözeltisi, 1ml 24.4 U/ml enzim aktivitesine sahip lakkaz enzimi, aracı olarak 1 ml vanilin ilave edilmiştir ve inkübasyon süresi ve sıcaklığı 30 dk ve 35 °C’de sabit tutulmuştur.

Sonuçlar 525 nm (Reaktif Red 198 için) ve 521 nm (Rem Red RR için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

3.2.4.1.4. Enzim Miktarının Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Enzim miktarının enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek amacıyla 0.5-4 ml arasında değişen miktarlarda ve 24,4 U/ml aktivitede enzim kullanılmıştır. Çalışma koşulları pH 5, 50 mg/l başlangıç boya konsantrasyonu, inkübasyon süresi 30 dk ve inkübasyon sıcaklığı 35°C’ dir. Sonuçlar 525 nm (Reaktif Red 198 için) ve 521 nm (Rem Red RR için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

3.2.4.1.5. Ortam Sıcaklığının Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Ortam sıcaklığının enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek için 20-70 °C arası sıcaklıklar denenmiştir. Diğer çalışma koşulları pH 5, 50 mg/l boya konsantrasyonu, 1 ml 25,3 U/ml aktiviteye sahip enzim ve inkübasyon süresi 30 dk’ dır.

Sonuçlar 525 nm (Reaktif Red 198 için) ve 521 nm (Rem Red RR için) dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kontrol grubu olarak diğer koşullar sabit tutulup enzim yerine denatüre enzim ve boya çözeltisi kullanılmıştır.

3.2.4.1.6. Đnkübasyon Süresinin Enzimatik Dekolorizasyona Etkisi

Đnkübasyon süresinin enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek amacıyla 5.-15-30-45-60-120 dk ve 12 - 24 saatler denenmiştir. Daha önce belirlenen parametreler

Đnkübasyon süresinin enzimatik dekolorizasyona etkisini belirlemek amacıyla 5.-15-30-45-60-120 dk ve 12 - 24 saatler denenmiştir. Daha önce belirlenen parametreler