L plantarum'un Büyüme Kinetiği

16S rRNA gen sekanslama sonuçlarına göre L. plantarum olarak belirlenen suşlar, 37°C'de 24 saat süreyle MRS sıvı besiyerinde inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda yapılan kültürel sayım sonucunda en yüksek canlı hücre popülasyonuna ve aynı zamanda OD600 değerine sahip olan suş seçilerek büyüme kinetiği, biyokütle özellikleri ve ekşi

hamur oluşturma kabiliyeti araştırılmıştır. Ayrıca bu suşun yağsız süt ortamında farklı kriyoprotektanlar eşliğinde dondurarak kurutulmasıyla toz kültürleri elde edilmiştir.

MRS sıvı besiyerinde 37°C’de L. plantarum gelişimi 28 saat boyunca takip edilerek, belirli zaman aralıklarında kültürel sayımları ve optik yoğunlukları belirlenmiştir. Elde edilen verilerle zamana karşı çizilen L. plantarum'un gelişme ve OD600 eğrileri Şekil 4.3'te gösterilmiştir. Grafikten de görüleceği gibi, L. plantarum

gelişimi; yaklaşık 3−4 saatlik bir lag (gecikme) fazının ardından 18 saat süren eksponansiyel (logaritmik) faz ve daha sonra da 4 saat süren durağan (stasyoner) faz ile özetlenebilir.

Şekil 4.3. MRS sıvı besiyerinde 37°C'de 28 saat boyunca anaerobik şekilde inkübe edilen L.plantarum’a ait büyüme ve OD600 eğrileri ( OD600, • cfu/ml, — polinom uyumlaması(fit))

Yeni hazırlanmış bir besiyerine inoküle edilen hücreler, bu yeni ortama adapte olana kadar hücre kütlesinde ve sayısında artış gözlenmemektedir. Hücrelerin ortama adaptasyonu sırasında geçen bu süre gecikme veya lag fazı olarak adlandırılmaktadır. Lag

fazının uzunluğu, mikroorganizmanın yaşı ve hasarlı olup olmadığı gibi fiziksel durumunu etkileyen faktörlere, daha önce saklandığı ortam koşullarına ve yeni inoküle edildiği besiyerinin doğasına bağlı olarak değişebilmektedir (Tunail, 2009). Kültüre alınan mikroorganizma metabolik olarak aktifse, yani eksponansiyel fazda ise lag fazının süresi daha kısa olmaktadır. Şayet mikroorganizma daha düşük aktiviteye sahipse, yani durağan fazındaysa lag fazının süresi uzamaktadır (Mellefont ve ark., 2003).

Bu çalışmada kullanılan L. plantarum suşu, dondurulmuş kültürden alındıktan sonra 18-20 saat boyunca aktifleştirilerek termal şok oluşumu en aza indirilmeye çalışılmıştır. Aktifleşen kültürlerin, tekrar yeni kültür ortamına aktarılması sonucunda 3−4 saatlik bir lag fazı sergilediği görülmüştür. Bu, hücrelerin yeni ortama adaptosyonu için gerekli olan süredir. Endüstriyel üretimler için uzun bir süre gibi görünse de, ortama aktif kültürler ilave edilerek lag fazının kısaltılması veya sürekli kültür ortamında lag fazına ihtiyaç kalmadan log fazına geçilmesi mümkün olmaktadır.

Büyüme hızının kademeli olarak arttığı kısa bir dönemi takiben, hücrelerin sabit ve maksimum bir büyüme gösterdiği süreç, log veya eksponansiyel faz olarak bilinmektedir. Eksponansiyel faz sırasında, hücreler iki katına çıkarak gelişmektedirler. Zamana bağlı oluşan yeni organizma sayısı, mevcut popülasyonla orantılıdır. Başka bir deyişle, biyokütle konsantrasyonundaki artış, başlangıçtaki biyokütle konsantrasyonu ile orantılıdır. Bu aşamadaki büyüme oranı, mikroorganizma türüne ve gelişme koşullarına (besin konsantrasyonu, havalandırma vb.) bağlıdır (Prado Barragán ve ark., 2016; Stanbury ve ark., 2017). Bu çalışmada L. plantarum’un lag fazı ile durağan fazı arasında 18 saatlik bir gelişme evresi olduğu gözlenmiştir. Ancak bu süre zarfı içerisinde 10 saat boyunca hücre popülasyonunun sabit hızla arttığı tespit edilmiş ve buna göre kinetik hesaplamaları yapılmıştır.

L. plantarum’un durağan fazı yaklaşık olarak 4 saat sürmüş ve sonrasında ölüm

fazına geçtiği görülmüştür (Şekil 4.3). Durağan fazda, besin maddelerinin konsantrasyonunun azalması ve bakteriler tarafından sentezlenen metabolitler, bakteri gelişimini durdurmaktadır ve bunun sonucunda gelişme eğrisinde yatay ve oldukça düz bir çizgi oluşmaktadır. Yetersiz besin ortamı popülasyonun gelişimini oldukça azaltmaktadır. Bunun yanı sıra, bakterilerin karbonhidrat kaynaklarını fermente ederek, laktik asit ve diğer organik asitleri sentezlemeleri sonucunda oluşan bu asitlik ile kendi gelişimlerini inhibe etmeleri söz konusudur. Ayrıca, bilhassa fermantasyon yapan anaerobik bakterilerin çok çeşitli toksik maddeler üretmesi ve oluşan tüm bu metabolitlerin statik kültürlerde uzaklaştırılmasının mümkün olmaması nedeniyle

öncelikli olarak duyarlı hücrelerin ölümü gerçekleşmektedir. Daha dayanıklı olan hücreler, depo maddelerini ve proteinleri kullanarak yaşamlarını sürdürebilecek kadar az bir enerji sağlayıp canlı kalmaktadırlar. Bu nedenledir ki, bu fazda, hücre bölünmesi ile hücre ölümü arasında kurulan denge ile toplam mikroorganizma sayısı uzunca bir süre değişmeden sabit bir şekilde kalmaktadır (Tunail, 2009). Büyüme eğrisinin son aşaması, net bir hücre kaybı ile karakterize edilen ölüm aşamasıdır. Ölüm aşamasında bile, metabolize olan ve bölünen bireysel hücreler olabilmekte, ancak çok daha fazla canlı hücre kaybı söz konusudur. Ölüm fazı çoğunlukla logaritmiktir, ancak hücre ölüm hızı eksponansiyel fazdaki büyüme hızından genellikle daha yavaş olmaktadır (Maier ve Pepper, 2015).

Şekil 4.4. MRS sıvı besiyerindeki 37°C'de 28 saat boyunca izlenen L. plantarum gelişiminin doğal logaritması ve µ değerinin (spesifik büyüme oranı) hesaplanması (•: ln (X / X0), −: polinom uyumu).

𝑒 (Euler sayısı, 𝑒=2.71828...) temelli logaritmik fonksiyonlar doğa bilimlerinde daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Bir 𝑒-fonksiyonuna matematiksel olarak "doğal logaritmik fonksiyon" denmektedir (Widdel, 2007). Bu amaçla, L. plantarum'un relatif popülasyon büyüklüğünün doğal logaritması alınarak zamana karşı grafiği çizilmiştir (Şekil 4.4). Logaritmik büyüme fazındaki eğrinin eğimi L. plantarum’un spesifik (özgül) büyüme hızını vermektedir ve µmax 0.551 sa-1 olarak hesaplanmıştır. Buna dayanarak; L. plantarum’un ikilenme (jenerasyon) süresi (g veya td) aşağıdaki denklikten 1.26 sa olarak

𝑋₁ = 2𝑋₀ 𝜇 =ln 2_𝑡

𝑑 𝑡𝑑 = 0.693

0.55 𝑠−1 𝑡𝑑 = 1.26 𝑠𝑎

Bu, L. plantarum hücrelerinin, metabolik olarak en aktif olduğu yani büyüme hızının en fazla olduğu fazda, 1.26 saatte (~76 dk) bir bölündüğü anlamına gelmektedir. Oluşan yeni hücrelerin tekrar olgunlaşıp bölünmesi için geçen süre jenerasyon süresini vermektedir. Bu süre sonunda hücre popülasyonunun 2 katına çıktığı yorumu yapılabilir. Log fazındaki jenerasyon sayısı (n), yaklaşık 10 sa süren toplam logaritmik faz süresinin, 1.26 sa süren jenerasyon süresine oranlanması ile 8 olarak hesaplanmıştır:

𝑛 =

=

=

MRS sıvı besiyeri ortamında ve 37°C sıcaklıkta, L. plantarum eksponansiyel fazı süresince 8 jenerasyon üremiştir. Yani başka bir deyişle, bu süre zarfında mevcut popülasyon 8 defa iki katına çıkmıştır. Mikroorganizmaların bölünme ve gelişme hızı aynı olmamaktadır, her bir mikroorganizma için aynı koşullar sağlansa bile, cinslerin veya türlerin genetik özelliklerine bağlı olarak gelişme hızı da değişmektedir (Tunail, 2009). Çizelge 4.3’te bazı mikroorganizmaların optimum koşullardaki gelişme hızlarına örnekler verilmiştir.

Çizelge 4.3. Bazı mikroorganizmaların optimum koşullardaki gelişme hızları (Tunail, 2009).

Mikroorganizma Jenerasyon süresi

Escherichia coli 20 dk

Pek çok toprak bakterisi 60−150 dk

Hızlı gelişen ve asit oluşturan Rhizobium türleri 2−4 sa Yavaş gelişen ve alkali oluşturan Rhizobium türleri 6−7 sa

Nitrosomonas ve Nitrobacter türleri 5−10 sa

Mycobacterium 12−18 sa

Eksponansiyel faz sırasında fazla besin içeren ortamlarda mikroorganizmalar maksimum spesifik büyüme hızında (µmax) büyürler. µmax değerinin kinetik ölçümünün

yapıldığı geçerli koşullar altındaki maksimum büyüme hızı olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle µmax değeri besiyeri bileşimi, pH ve sıcaklık gibi faktörlere bağlı olarak

bir karbon kaynağının, amino asitlerin, peptitlerin, yağ asitlerinin, vitaminlerin ve nükleik asitlerin bulunduğu bir büyüme ortamı gerekmektedir. Bu ortam, de Man, Rogosa ve Sharpe (MRS) olarak bilinen standart bir laboratuvar besiyeri ile sağlanabilmektedir. Temel azot kaynağı olarak sığır eti, maya özü ve pepton içeren MRS ortamı, laboratuvar çalışmaları için Lactobacillus cinsi de dahil olmak üzere laktik asit bakterilerinin büyümesini desteklemek için kullanılmaktadır (Mis Solval ve ark., 2019). Bu çalışmada, araştırılan L. plantarum türüne ait büyüme kinetiği sonuçlarının kaynak olabilmesi amacıyla, gelişimi esnasında optimum besiyeri ortamını sağlayacak MRS besiyeri kullanılmıştır. L. plantarum için elde edilen bu sonuçlar referans olarak kabul edilerek, gelecek çalışmalarda besiyeri ortamında veya gelişme sıcaklıklarında yapılacak değişiklikler ile farklı kinetik modellerin oluşturulmasına temel sağlayacaktır.

Mikrobiyal büyüme sırasında hücre sayısı konsantrasyonundaki artışın kuru biyokütle konsantrasyonundaki artışa eşdeğer olması beklenmektedir. Ancak, hücre sayımı ve biyokütle ölçümlerinden elde edilen büyüme parametreleri genellikle eşdeğer olmamaktadır (Egli, 2009). Bu durum, büyük hücre popülasyonlarında hücrelerin gelişimi sırasında protein, DNA, RNA ve ortalama hücre hacmi gibi değişkenlerin artış hızlarının farklı olmasıyla açıklanabilir. Aynı zamanda, bölünme aşamasına ulaşan tek bir hücrenin daha büyük boyutlarda ve yeni oluşan hücrelerin daha küçük boyutlarda olmasından da etkilenebilmektedir. Ayrıca hücre büyümesinin ölçülme tekniğinin büyüme eğrisinin şeklini etkilediği de görülmektedir. Örneğin, büyüme kültürel plak sayımları yerine optik yoğunluk ile ölçüldüğünde (Şekil 4.3’teki iki eğri karşılaştırıldığında), ölüm fazının başlangıcı kolayca tespit edilememektedir. Bu yaklaşımların, hücre gelişimini ölçmek için yaygın olarak kullanılmasının nedeni ise, mikrobiyologların en çok ilgi duydukları büyüme fazlarının, lag fazı, log fazı ve durağan fazın başlangıcı olmasıdır (Maier ve Pepper, 2015).