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Nos últimos anos, os diversos modos de terapia celular, especialmente com CTMs, têm sido amplamente empregados pelas áreas biomédicas, de pesquisa e desenvolvimento. Estudos envolvendo a aplicação de células-tronco, na maioria das vezes, abrangem enfermidades de difícil reparação ou tratamento, como as autoimunes, lesões osteomusculares, doenças cardíacas ou metabólicas e alterações neurológicas. Porém, uma menor parte das pesquisas acaba por englobar praticamente todas as áreas médicas, biomédicas e farmacêuticas, tornando esse tipo de estudo extremamente explorado. Inúmeras publicações na área são difundidas diariamente e em ritmo acelerado. Esse turbilhão de informações sobre o assunto decorre muitas vezes em dados não confiáveis, estudos duvidosos e afirmações errôneas. É necessário, de forma invariável, erradicar a vulgarização do assunto, assim como inibir a inadequada aplicação desse tipo de terapia. Esse tópico ainda deve continuar sendo analisado, já que grande parte dos conhecimentos é ainda preliminar.

Como exemplo, ainda não há um consenso sobre a “dose” ideal, utilizada em cada tipo de tratamento. Sabe-se, porém, que a concentração de células no local da lesão representa um fator decisivo no sucesso do tratamento. O implante de altas concentrações de CTMs favorece a diferenciação condrogênica e a produção de matriz extracelular. A aderência celular é dependente de moléculas de adesão, e o mecanismo de produção dessas moléculas de adesão é beneficiado pela alta densidade celular, que promove maior interação entre as células (LI et al., 2014). A literatura mais recente sugere que implantes de CTMs devem possuir cerca de 107 _{células, já que essa} concentração tem apresentado melhores resultados do que concentrações inferiores, como a de 106 _{células por tratamento (YAMADA et al., 2013; LEE et al., 2013;} CARVALHO et al., 2014).

Em contrapartida, LEE et al. (2013) observam que uma alta concentração celular dentro de uma articulação pode acrescer consideravelmente o número de células aderidas junto à macrófagos na membrana sinovial, podendo gerar uma reação inflamatória e proliferações sinoviais indesejáveis. Para esta experimentação foram utilizadas 107 _{células por cada lesão condral tratada. Em nosso experimento não foram} observadas proliferações ou reações sinoviais indesejáveis, sendo evidenciado um resultado favorável após o implante de CTMs em gel de PRP nos grupos B e C. Porém, em estudos adicionais, seria prudente a realização de uma biópsia sinovial e marcação

das CTMs, verificando-se: a porcentagem de células que permanecem aderidas na membrana sinovial, assim como a realização de análises, através de ensaios imunoenzimáticos, por exemplo, conferindo a interação das CTMs aderidas aos macrófagos residentes, no caso de lesões experimentalmente induzidas e possivelmente em animais apresentando a doença em seu curso natural.

As pesquisas atuais apontam para a utilização das CTMs associadas à um arcabouço biocompatível ou em formatos que possibilitem o acréscimo da densidade celular e permitam a ancoragem das células no local da lesão. Diversos estudos têm utilizado CTMs encapsuladas em microesferas de colágeno, alginato ou no próprio PRP (TAY et al., 2012; XIE et al., 2012; LEE et al., 2013; YAMADA et al., 2013; LI et al., 2014; CARVALHO et al., 2014). Conglomerar as CTMs dentro de um arcabouço biocompatível, ou a realização da microencapsulação, é capaz de proporcionar um ambiente semelhante ao que ocorre durante o processo de condrogênese, no decorrer do desenvolvimento embrionário, onde há um ambiente tridimensional, com grande interação entre as células (LI et al., 2014). Sendo assim, a utilização do gel de PRP nesse estudo, como um arcabouço para suportar o implante das CTMs, mostra-se bastante efetivo, e seguramente auxiliou que as CTMs a expressassem todo o seu potencial e se fixassem no local da lesão.

Tendo o conhecimento de que a cartilagem hialina é um tecido de difícil reparação intrínseca, não apresentando organização linfática ou vascularização, o arcabouço de PRP favorece de forma importante o processo inicial de cicatrização, fornecendo o suporte e a orientação tridimensional, do gel de fibrina, e altas concentrações de fatores de crescimento e citocinas presentes no PRP (XIE et al., 2014). Observamos no nosso estudo a formação de vasos, e maior metacromasia (azul de toluidina em contato com glicosaminoglicanos e proteoglicanos) histopatológica nos grupos tratados com CTMs e PRP-gel, o que provavelmente comprova a influência da terapia celular no processo de reparação, onde há um favorecimento da neovascularização em decorrência da produção de VEGF pelas células-tronco e a presença desse mesmo fator de crescimento no PRP, além do estímulo à produção de matriz extracelular, principalmente proteoglicanos, pela ação autócrina e parácrina das CTMs, além da grande concentração de IGF-1, PDFG e TGF-β no PRP. Tais fatores contribuíram inevitavelmente para o melhor preenchimento da lesão condral, observado em cinco meses. Tendo em vista que o tecido cartilaginoso deve ser resistente à compressão, atrito e deslizamento, é importante ressaltar que estudos em longo prazo

devem ser realizados a fim de analisar a diferença entre os grupos tratados e controle após longo período do tratamento e provável retorno às atividades esportivas, verificando a produção de matriz extracelular, em especial o colágeno tipo II, e consequentemente a qualidade do tecido de reparação e a apresentação clínica do paciente.

Em alusão ao implante de CTMs dentro do arcabouço de PRP, BEITZEL et al. (2014) relataram que as CTMs podem ter dificuldade em se proliferar e ter a viabilidade comprometida em arcabouços com altas densidades de fibrina obtidos de plasmas rico em plaquetas. A fibrina presente no arcabouço de PRP poderia impedir o comportamento natural das CTMs, mesmo na presença de altas concentrações de fatores de crescimento. FARRELL et al. (2012) igualmente relataram que em grandes estruturas tridimensionais, pode haver morte celular no centro e na parte inferior dos arcabouços, e afirmaram que a viabilidade das CTMs decai rapidamente nas primeiras semanas após o implante. Sendo assim, esse estudo expõe ainda uma variável a ser investigada: o implante celular dentro de um arcabouço de PRP-gel, onde ainda há contradições sobre o real comportamento celular. Seria importante averiguar qual a viabilidade das CTMs dentro do arcabouço de PRP em estudos in vitro e principalmente in vivo, já que o ambiente articular de animais portadores de osteoartrite ainda apresenta inúmeros outros fatores que podem interferir na viabilidade dessas células, como a presença de moléculas próinflamatórias, enzimas catabólicas, ação de macrófagos, linfócitos, além da mobilidade própria da articulação. Ainda assim, analisando os resultados expostos pela literatura atual (CHEN et al., 2011; YAMADA, 2011, TAY et al., 2012; XIE et al., 2012; FILARDO et al., 2013; LEE et al., 2013; PHAM et al., 2013; YAMADA et al., 2013; LI et al., 2014) e observados nesse trabalho, o tratamento com as CTMs no arcabouço de PRP associados às microfraturas parece ser promissor, já que as CTMs quando aplicadas sem uma base tridimensional pode perder seu potencial condrogênico ou se tornar hipertróficas (VINATIER et al., 2009).

Apesar da sua simples obtenção, o PRP utilizado em qualquer terapia deve ser minuciosamente preparado, de forma asséptica, e com a concentração plaquetária mínima para que haja a ação esperada. A quantidade de plaquetas e as concentrações de IGF-1 observadas após a análise do PRP utilizado no tratamento foram satisfatórias para esse fim de acordo com a literatura (SCHNABEL et al., 2007; TEXTOR et al., 2013). Através de dupla centrifugação, concentrações acima de 700.000 plaquetas/µL são aceitáveis (TEXTORa _{et al., 2013; TEXTOR et al., 2013). Diversos tipos de}

mecanismos para obtenção de PRP vêm sendo utilizados, dentre eles, o filtro E-PETTM que decorre em concentrações mais elevadas de plaquetas, acima de um milhão, e apresenta fácil manuseio. É importante ressaltar que, os diferentes métodos de obtenção de plaquetas resultam igualmente em distintas composições do PRP, como o aumento do número de leucócitos ou diminuição da fração proteica (TEXTORa _{et al., 2013;} TEXTOR, 2014). O PRP utilizado nesse trabalho foi adequado, com baixo número de leucócitos (sendo desprezada a zona de névoa), concentração plaquetária e quantificação do fator de crescimento IGF-1 dentro da média esperada (TEXTOR, 2014). Inferimos que a retirada da fração que contém os leucócitos diminui a possibilidade de reações inflamatórias adversas, a produção exacerbada de citocinas próinflamatórias e o acentuado influxo celular. Não há estudos padronizados na literatura que comparem a aplicação do PRP, com e sem a zona de névoa, no tratamento de lesões condrais, em equinos, em relação à qualidade de reparação, potencial imunogênico ou inflamatório do tratamento, composição celular e molecular do líquido sinovial, porém DRAGOO et al. (2014) relataram que o PRP rico em leucócitos e hemácias demonstraram ser citotóxico para sinoviócitos em humanos, além de serem capazes de ativar a inflamação através da liberação de IL-1, TNF-α e IL-6.

O PRP pode potencialmente gerar influxo celular para dentro da cavidade articular mesmo quando há o descarte da zona de névoa. Esse efeito se deve provavelmente à presença de inúmeras citocinas presentes no PRP. A ativação do PRP com trombina também parece ter um possível efeito imunogênico. A trombina pode transcursar efeitos imunológicos subclínicos, decorrentes principalmente de resposta imunológica exacerbada ou hipersensibilidade individual, efeito proteolítico ou por uma resposta articular imediata após a liberação “em massa” da alta concentração de fatores de crescimentos presentes nos grânulos plaquetários (TEXTOR et al., 2013). Anteriormente, YAMADA (2011) já relatou alterações no influxo celular do líquido sinovial de articulações tratadas com CTMs e PRP. No estudo atual não foram observadas reações clínicas adversas resultantes da aplicação dos tratamentos.

A associação desses tratamentos possui grande viabilidade de aplicação na rotina hospitalar. O gel de PRP apresenta fácil obtenção e é pouco oneroso. As células-tronco mesenquimais, devido ao grande número de pesquisas realizadas, tem se tornado cada vez mais acessível nas diferentes áreas médicas e biomédicas. Essa metodologia de tratamento é perfeitamente exequível após um pequeno tempo de treinamento do cirurgião. Além disso, a terapia celular convém para incrementar de forma significativa

o resultado de reparação da cartilagem articular já alcançado por métodos de estimulação da medula óssea ou debridamento do osso subcondral. As microfraturas consistem em um tratamento já bem conhecido e igualmente de fácil realização (TSUZUKI et al., 2014). No entanto, há varias discussões em torno desse método de tratamento, como possíveis formações de cistos em perfurações mais profundas (TSUZUKI et al., 2014), algumas falhas na reparação e na apresentação clínica à longo prazo (BAE et al., 2013), formação excessiva de fibrocartilagem superficial (CHEN et al., 2011) e degeneração da cartilagem adjacente (BEKKERS et al., 2013). Sendo assim, a associação de CTM/PRP-gel nesses casos pode melhorar de forma importante a qualidade de vida do paciente e a reparação condral.

A presença das CTMs em tratamentos de lesões condrais é benéfica não só pela sua atuação como fonte celular, resultando em proliferação e produção de matriz extracelular, mas igualmente como um tipo celular capaz de agir de forma importante secretando quimioatrativos, expressando diversas proteínas e sinalizadores. Alguns estudos sugerem que as CTMs exercem um papel importante na secreção de moléculas e fatores solúveis, capazes de neutralizar ou inibir citocinas próinflamatórias e principalmente linfócitos T (DI NICOLA et al., 2002; CHEN et al., 2008; MAZOR et al., 2014). Outros estudos observam que não só a presença de fatores solúveis, mas como a interação célula-célula é igualmente essencial na expressão das características imunossupressoras das CTMs (NAUTA & FIBBE, 2007; CHEN et al., 2008). Algumas moléculas como a IL-1, a PGE2, e o IFN-γ são essenciais para a expressão de características imunossupressoras das CTMs (SHI et al., 2010; HOLT et al., 2014), porém, inúmeros outros fatores podem estar envolvidos na expressão dessa propriedade (NAUTA & FIBBE, 2007). Observamos nesse estudo a influência que o implante de CTMs e PRP exerceu sobre a IL-1, sobre a PGE2, sendo necessária uma investigação ainda mais detalhada do comportamento que as CTMs apresentam quando aplicadas em uma cavidade articular comprometida pela osteoartrite natural e em modelos induzidos, levando em consideração as diferentes concentrações de moléculas próinflamatórias e citocinas presentes nessas articulações.

As células-tronco mesenquimais tendem a demonstrar um potencial efeito imunomodulador. Quando adequadamente estimuladas são capazes de liberar PGE2, fatores de crescimento, IDO, interleucinas anti-inflamatórias, reduzir a diferenciação de células polimorfonucleares, inibir a proliferação de células NK, reduzir a concentração de IFN-γ, inibir a ativação de linfócitos T e a maturação de monócitos. Porém, em

determinadas situações, esse mesmo tipo celular pode se apresentar como imunogênico, sendo positivas para o complexo de histocompatibilidade, apresentando antígenos, citotoxicidade e indução à apoptose (NAUTA & FIBBE, 2007). Sabe-se que a presença de IFN-γ é capaz de estimular as CTMs a apresentarem características imunossupressoras ou imunogênicas, dependendo da concentração local (NAUTA & FIBBE, 2007). Dessa forma, observamos que em trabalhos como o aqui apresentado, é importante o conhecimento da concentração de moléculas como a PGE2, a IL-1 e, ao mesmo tempo, o IFN-γ. Seria igualmente necessário ter a ciência, em estudos in vitro, em modelos experimentais e em casos de ocorrência natural, qual seria a quantidade ideal dessas moléculas, em uma cavidade articular, para tornar a ação das CTMs juntamente com o PRP impreterivelmente imunossupressora, otimizando a qualidade do tratamento empregado.